間接法測抗體
⑴基本原理
染色程序分為兩步,第一步,用未知未標記的抗體(待檢標本)加到已知抗原標本上,在濕盒中37℃保溫30min,使抗原抗體充分結合,然后洗滌,除去未結合的抗體。第二步,加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第一步發生了抗原抗體反應,標記的抗球蛋白抗體就會和已結合抗原的抗體進一步結合,從而可鑒定未知抗體。
⑵試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/L,pH7.4
熒光標記的抗人球蛋白抗體:以0.01mol/L,pH7.4的PBS進行稀釋。
搪瓷桶三只(內有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)
有蓋搪瓷盒一只(內鋪一層浸濕的紗布墊)
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
⑶實驗步驟
1)滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于已知抗原標本片,10min后棄去,使標本片保持一定濕度。
2)滴加以0.01mol/L,pH7.4的PBS適當稀釋的待檢抗體標本,覆蓋已知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內,37℃保溫30min。
3)取出玻片,置于玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗1-2次,然后按順序過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸5min,不時振蕩。
4)取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標本干燥,滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體。
5)將玻片平放在有蓋搪瓷盒內,37℃保溫30min。
6)重復操作3。
7)取出玻片,用濾紙吸去多余水分,滴加一滴緩沖甘油,再覆以蓋玻片。
8)熒光顯微鏡高倍視野下觀察,結果判定同直接法。
⑷注意事項
1)熒光染色后一般在1h內完成觀察,或于4℃保存4h,時間過長 ,會使熒光減弱。
2)每次試驗時 ,需設置以下三種對照:
① 陽性對照:陽性血清+熒光標記物
② 陰性對照:陰性血清+熒光標記物
③ 熒光標記物對照:PBS+熒光標記物
3. 已知抗原標本片需在操作的各個步驟中,始終保持濕潤,避免干燥。
4. 所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物,應始終保持在已知抗原標本片上,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色 。