樣品預處理
用5M鹽酸胍以1:1的比例稀釋200μL腦脊液（人腦脊液、猴腦脊液或加標人工腦脊液+5%大鼠血漿），并在室溫下振搖45分鐘。然后，用200μL 的4%H3PO4水溶液進一步稀釋樣品。
注意：對于加標樣品而言，在加標后、用鹽酸胍稀釋前，可在室溫下讓樣品平衡30分鐘。
固相萃取（SPE）
基于μElution 96孔型的Oasis? MCX
預處理：200μL甲醇
平衡：200μL 4% H3PO4水溶液
上樣：600μL預處理后的樣品
清洗1：200μL 4% H3PO4水溶液
清洗2：10% ACN水溶液
洗脫：2×25μL 75:15:10 ACN:水:NH4OH濃溶液
稀釋：25μL水
進樣量：20μL
肽名稱 | 前體離子 | 產物離子 | 產物離子ID | 錐孔電壓（V） | 碰撞能量（eV） |
β淀粉樣1-38肽 | 1033.5 | 1000.3 | b 36 | 33 | 23 |
β淀粉樣1-38肽的N15內標 | 1046 | 1012.5 | 30 | 22 | |
β淀粉樣1-40肽 | 1083 | 1053.6 | b 39 | 33 | 25 |
β淀粉樣1-40肽的N15內標 | 1096 | 1066.5 | 35 | 22 | |
β淀粉樣1-42肽 | 1129 | 1078.5 | b 40 | 28 | 30 |
β淀粉樣1-42肽的N15內標 | 1142.5 | 1091.5 | 35 | 28 |
表1：β淀粉樣肽及其N15標記型內標的MRM躍遷態和質譜條件
圖2：β淀粉樣1-42肽的典型ESI+MS/MS光譜
結果和討論
開發這些方法所遇到的最大挑戰就是克服溶解性、吸附性和聚集性問題并獲得能滿足該應用要求的足夠選擇性和靈敏度。適當的流動相和進樣溶劑構成以及明智選擇SPE洗脫溶劑僅僅是應對這些問題的幾個關鍵因素。
質譜分析
質譜分析在正離子模式下進行，因為4+前體的CID產生了幾種與固有的特異性b序列離子相對應的不同產物離子（典型光譜如圖2所示）。負離子模式下的MS/MS出現了明顯的水分流失。圖3給出了關于兩種方法特異性區別的一個示例。雖然對于溶劑標準品時使用負離子模式的總體靈敏度較高，但在基質存在時負離子模式的靈敏度優勢減弱，而正離子模式下的特異度和信噪比的提高對于腦脊液樣品中的準確定量具有決定性作用。
超高效液相色譜分析
圖4顯示了對這三種β淀粉樣肽的分離情況。雖然流動相中NH4OH的精確百分比對負離子靈敏度具有關鍵作用，但ESI+模式下的信號經證實對流動相構成的細微變化更具穩健性，可使液相色譜／自動取樣器至少在24小時以上的時間段中保持穩定。與此相反，50%或以上的ESI-信號在10-12小時后因流動相中NH4OH濃度的自然變化（揮發）而損失。這進一步強調了ESI+MS方法的穩健性。
固相萃取（SPE）
SPE使用Oasis? MCX（一種混合模式的吸附劑）進行，以加強萃取過程的選擇性。該吸附劑同時依賴于反相和離子交換保留機制，以從復雜腦脊液樣品中的其它高豐度多肽中選擇性分離β淀粉樣肽組分。使用特定的96孔Oasis? μElution提供了明顯的濃縮效果，無需溶劑揮干和復溶，從而盡可能減少了肽損失。此外，通過離子交換進行肽結合為整個方法提供了正交性。
在最初的方法開發過程中，萃取人工腦脊液時觀察到了大量非特異性結合（NSB）。我們添加了5%大鼠血漿（有一個不同的β淀粉樣肽序列），以消除NSB。
SPE是整個方法中較為重要的環節之一。對淀粉樣組分選擇性極高的分離再加上標準流速下UPLC的分辨率實現了對臨床前研究樣品的超快分析。