滾動式循環放大（RCA）法是一種能夠在恒溫條件下，使標記有寡核苷酸探針（與組織細胞內的核苷酸無相關性）的抗體（特異性一抗或第二抗）與組織細胞內的抗原結合后，在DNA聚合酶的作用下，加入的寡核苷酸進行循環擴增，產生一條擴增的DNA序列拷貝產物，此時，標記在抗體上的寡核苷酸得到有效擴增（109倍），擴增后的產物與后續加入的標記有示蹤物的寡核苷酸進行互補雜交，在抗原-抗體周圍形成眾多帶有標記示蹤物的雜交體，最后通過IHC方法再放大示蹤物。該方法具有很高的敏感性和特異性。首先要合成三條寡核苷酸探針（引物），然后將寡核苷酸與抗體結合，最后進行RCA免疫組化染色。
（一）寡核苷酸的合成與抗體連接寡核苷酸
L標記抗體用寡核苷酸
5,-AAAAAAAAAAAAAAAAATGATCACAGCTGAGGATAGGACATGCGA-3,
2. 循環放大寡核苷酸
5,-PCGCATGTCCTATCCTCAGCTGACAGAACTCACCTGTTAGACGCCACCAGCTCCAACTGTAAGATCGCTTAT-3,
3. 帶有標記物的互補檢測用寡核甘酸
5,-XACTGTGAAGATCGCTTATX-3,（X=生物素），或用5,-FACTCTGAAGATCGCTTATF-3,（F=熒光素）；或用5,-HRPACTGTGAAGATCGCTTAT HRP-3,（HRP=辣根過氧化物酶）。
（二）寡核苷酸與抗體的結合
連接用的抗體可以是特異性一抗，也可以是第二抗體或其他的連接二抗，如抗地高辛（Dig）、抗熒光素（FITC）或抗生物素（biotin）二抗。
1. 抗體的脫鹽和活化
首先對抗體免疫球蛋白進行脫鹽，然后進行抗體活化。在41
nmol抗體分子中加入410mmol的GMBS[硫代-N-（4-馬來酰亞胺丁酰）硫代丁二酰亞胺，sulfo-N-（4-maleim-
idobutyryloxy）sulfosuccinimide],暗處，37℃，在氮氣中30
rain,移人室溫中繼續反應30min,用PD-10色譜柱（用pH7.5
PBS平衡柱子）除去多余的磺化-GMBS,將活化抗體4℃濃縮。此時每一個抗體分子中含有多個馬來酰亞胺，可以用Ellman's試劑滴定活化抗體的量，主要測定抗體分子上的巰基。抗體活化后與寡核苷酸連接。
2. 活化抗體與寡核苷酸結合
將28.1nmol磺化GMBS活化抗體和142 nmol5硫醇寡核苷酸混合，總體積為825ul,室溫中反應2h,隨后移人4℃中反應過夜。
3. 純化結合物
純化結合物一般先用陰離子交換色譜柱Q-sepharose（先用梯度鹽洗柱，然后加樣，洗脫，收集結合物），再用SephadexG-200色譜柱除去游離的寡核苷酸。純化后結合物中寡核苷酸和抗體之比為10:1，多數情況下，1個抗體分子可結合3~5個寡核苷酸。
（三）RCA免疫組化染色
（1）石蠟切片常規脫蠟至水，抗原修復后，PBS洗3×3min。
（2）滴加特異性一抗，37℃孵育1h，PBS洗3×3min。
（3）滴加適當稀釋的寡核苷酸標記二抗IgG 200nmol/L（用100mmol/L谷氨酸鉀-PBS稀釋），37℃孵育30min，PBS洗3×3cm，用100mmol/L谷氨酸鉀洗。
（4）循環寡核苷酸（170mmol/L），用φ29緩沖液稀釋[緩沖液內含250mmol/L（pH7.5）Tris-HCl，50mmol/L
MgCl2，1mg/ml BSA，lmmol/L dATP，1mmol/L dCTP，1mmol/LdGTP，0.75
mmol/LdTTP，0.25mol/LFITC-12-dUTP]，40ul/每片，37℃孵育30min，不洗，每張切片加入1ulφ29
DNA聚合酶（0.4U/ul），37℃繼續反應30min，PBS洗3×3min。
（5）免抗FITC-AKP結合物1:1000稀釋，37℃30min;PBS洗3× 3min；0.02mol/LTris-HCl（pH9.0內含氯化鎂、左旋咪唑）洗20min.
（6）NBT/BCIP顯色30~240min，核固紅襯染。
（7）常規樹膠封片，結果觀察。