溶菌酶的溶菌作用

[基本原理]
溶菌酶的殺菌機理是其作用于細菌細胞壁的粘肽層，粘肽是細菌的細胞壁主要成分。溶菌酶能切斷粘肽結構中的 N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β- 1,4糖苷鍵，破壞粘肽支架，使細胞壁破壞。由于細菌細胞壁的重要功能之一是保護細菌，即抗低滲，故細菌失去細胞壁的保護作用后，在低滲環境中可發生溶解。溶菌酶的主要作用對象是革蘭氏陽性菌。革蘭氏陰性細菌細胞壁粘肽層外還有脂多糖、外膜和脂蛋白結構，故在一般情況下溶菌酶不易發揮直接做用。
[實驗材料]
? 溶壁微球菌（ M.Lysodeikticus）：本菌是由空氣中分離出的一種革蘭氏陽性菌，對人不致病，菌落黃色，普通瓊脂培養基生長良好，每月傳代一次或凍干保存，用于制備溶壁微球菌瓊脂平板。
? 標準溶菌酶：稱取溶菌酶標準純品，用 1/15mol.L -1 PBS配制為1000ug/ml原液，并稀釋為100、50、10 ug/ml標準液，用前保存在冰箱中；用于陽性對照及制備標準曲線。
? 唾液：用無菌平皿收集唾液，可在同學間收集。
? 其它：無菌打孔器（孔徑 2mm），無菌毛細吸管、米尺等。
[實驗方法]
? 用無菌打孔器在溶壁微球菌瓊脂平板上打孔，用針頭挑出孔內瓊脂，孔徑 2mm左右，孔距5-20mm。
? 用毛細吸管取新鮮收集的唾液加入瓊脂孔內，每孔加一滴，每滴約有 0.025ml,同時加標準溶菌酶作陽性對照。
? 置 24-28 C°下12-18h觀察結果。
[實驗結果]
用小米尺或三角板量取小孔周圍溶菌環直徑，并作記錄，可與標準溶菌酶陽性對照作對比觀察。
如需定量測定檢品（唾液）中的溶菌酶含量，可將上述各種稀釋度的溶菌酶標準溶液，分別加入小孔中，同法測定溶菌環直徑，用半對數紙制成標準曲線，檢品中的溶菌酶含量可從標準曲線上查出。
[附錄]
? 溶壁微球菌瓊脂平板的制作：①溶壁微球菌在使用前于瓊脂斜面上傳代一次，然后接種于普通瓊脂平板 ,37C°培養24小時，用1/15mol.L -1 PBS或無菌蒸餾水洗下菌苔，洗滌兩次，2000r/min，離心30min，棄上清，稱量沉淀物濕重, 用無菌蒸餾水配成100mg/ml的菌液。②稱取優質瓊脂粉1g加入1/15mol.L -1 PBS 100ml,制成1%瓊脂。③取上述菌液1ml, 加入加熱融化并放至50-60 C°的瓊脂中，搖勻傾注平板。冷凝后即為溶壁微球菌瓊脂平板。
? 1/15mol.L -1 PBS的制備：①1/15mol.L -1 KH2PO4: KH2PO4 9.07g加蒸餾水至1000 ml；②1/15mol.L -1 Na2HPO4: 1/15mol.L -1 Na2HPO411.87g加蒸餾水至1000 ml；③1/15mol.L -1 PBS(pH6.4)：取1/15mol.L -1 KH2PO4 73ml加1/15mol.L -1 Na2HPO427ml,加NaCL0.5g即為pH6.4的1/15mol.L -1 PBS