清華大學Nature子刊：將Cas9應用于分子克隆

　　在4月21日的《自然實驗手冊》（Nature Protocols）雜志上，清華大學的朱聽（Ting Zhu）研究員與博士生姜文君（Wenjun Jiang）撰文，詳細介紹了利用一種叫做Cas9輔助靶向染色體片段（CATCH）的方法，靶向分離及克隆100kb微生物基因組序列的優化實驗方案。

　　朱聽研究員的主要研究方向包括合成生物學、人造細胞；新一代高通量DNA測序、宏基因組學；高通量DNA測序在癌癥和傳染病等疾病領域中的應用；生命的起源、遠古生命與極端條件下生命體的發現與測序。

　　隨著各種微生物基因組測序工作的不斷完成和序列信息的大量累積，微生物基因組研究的重點已從結構基因組學轉為功能基因組學，大量未知功能的基因和基因簇有待大家去解析。在細菌的基因組中，功能密切相關的基因常聚集在一起，形成一個大的基因簇或操控子。很多細菌的基因組中存在基因組島，與細菌的毒力、耐藥等密切相關，它們常作為一個整體在細菌之間進行轉移。要分析基因簇或基因組島這些長基因組序列的功能，需要對整個基因簇或基因組島進行遺傳操作。

　　DNA克隆是基因功能研究中最為基礎和關鍵的內容。目前，PCR是DNA克隆中最常用的方法。但該方法可在產物中引入突變，并且隨著PCR產物長度的增加，突變率也增加。另一個獲得長基因組序列的途徑就是采用限制性酶來消化基因組DNA。然而，作為一種非靶向性方法，從大量的限制性消化產物中挑出特異的目的序列非常具有挑戰且麻煩。因此，常用傳統PCR或限制性酶消化通常難于直接獲得這樣的長基因組序列，克隆這些序列仍然是分子生物學中一個技術障礙。

　　在2015年9月的Nature Communications雜志上，朱聽研究員與特拉維夫大學的Yuval Ebenstein，以及中科院微生物研究所的婁春波研究員合作，報告稱他們開發出了一種叫做CATCH的方法，其能夠一步靶向克隆幾乎任意的、長達100kb的長細菌基因組序列。在體外借助于RNA引導的Cas9核酸酶在兩個指定位點從細菌染色體中切下目標基因組片段，然后通過Gibson組裝將其連接到克隆載體中。這一技術可成為目標克隆大基因簇一種有效的分子工具（清華大學Nature子刊：利用Cas9實現基因克隆 ）。

　　在這篇Nature Protocols文章中，作者們描述了CATCH克隆方法的一種優化實驗方案。這一實驗方案采用的是標準的實驗室設備，僅需在幾天內經歷約8小時的實驗時間，它有潛力簡化及加速從微生物中分離及克隆大基因簇的研究工作。

　　所有的分子生物學家都會告訴你：將DNA片段克隆到載體中去是一件棘手的事情。研究人員要查看復雜的限制性酶切圖譜，費盡心力找到適當的限制性內切酶組合，然后熬過漫長的連接和轉化過程，希望能夠生成少數正確插入的克隆。那如果能夠擺脫所有這些繁瑣的步驟，在任意位點切割質粒，然后無縫插入你的靶DNA，會怎么樣呢？南佛羅里達大學Morsani醫學院變態反應和免疫學部的研究人員轉向了基因組工程系統——CRISPR/Cas9，開發出了體外“CRISPR克隆”法（華人學者技術突破：將CRISPR應用于分子克隆 ）。

　　來自荷蘭Hubrecht研究所和烏特勒支醫學中心（UMC Utrecht）、麻省理工學院的研究人員稱，他們開發出了一種自身克隆CRISPR/Cas9(scCRISPR)技術，可以繞開基因編輯過程中所有的克隆步驟，在數小時內完成CRISPR/Cas9介導基因突變及位點特異性轉基因敲入。他們的研究成果發布在2015年10月29日的《Stem Cell Reports》雜志上（Cell子刊突破：無需克隆的CRISPR新技術 ）。