流行性腦脊髓膜炎(epidemiccerebrospinalmen-ingitis，簡稱流腦)是一種嚴重的呼吸道傳染病，可引起較高的病死率和致殘率。即使在醫療條件比較完善的地方，流腦病死率仍高達5%～10%，10%～15%的幸存者會遺留明顯的神經系統后遺癥(精神異常、耳聾、癱瘓和驚厥等)，嚴重危害人類健康［1］。
腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)是流腦的病原菌，根據莢膜多糖化學結構可將其分為13個血清群，其中A、B、C、W135和Y群是引起流腦的主要血清群，以C群毒力最強［2］。多位點序列分型(multilocussequencetyping，簡稱MLST)是通過對7個管家基因的測序結果，用核苷酸序列變異來發現細菌型別差異的分型方法［3］。由于腦膜炎奈瑟菌分子型別具有基因多態性，MLST作為一項新型分子分型技術，已被廣泛應用于腦膜炎奈瑟菌的鑒定研究［4－5］。中國大陸目前主要流行的腦膜炎奈瑟菌菌群是C群ST-4821［6］。為了解2015年河南省1例流行性腦脊髓膜炎(流腦)病例菌群的分子分型特征，本研究收集患者的腦脊髓液和血液及37例密切接觸者的咽拭子和血液，進行多位點序列分型(multilocussequencetyping，MLST)，現將結果報告如下。
1.材料和方法
1．1病例信息
男性，14歲，學生，在學校集體宿舍居住，發病前10d外出史不詳。2015年9月18日以“頭痛、發熱”為主訴收住鄭州大學第二附屬醫院。入院檢查:T39．5℃，皮膚有淤點和淤斑等癥狀，并且伴有頸項強直和意識障礙，克氏征和布氏征均為陽性。實驗室檢查:血液中白細胞總數達到11．6×109個/L，中性粒細胞高達87%，腦脊液呈混濁狀態。2015年9月20日死亡。
1．2標本
患者的腦脊液和血液，37例密切接觸者的咽拭子和血液。
1．3主要試劑及儀器
腦膜炎奈瑟菌凝集血清購自ThermoFisher公司;2×PremixExTaq和dH2O均購自Takara公司。APINH生化鑒定試紙條購自法國生物梅里埃公司;A群和C群流腦多糖抗體IgG檢測試劑盒購自鄭州億特生物技術有限公司;革蘭氏染色液購自BASO公司;血培養瓶、雙抗和無抗巧克力平板，均購自鄭州安圖生物工程有限公司;離心機購自Eppendorf公司;CO2培養箱購自ThermoFisher公司;MagNAPureLC2．0全自動核酸分離純化系統購自Ｒoche公司;熒光定量PCＲ儀和酶標儀均購自Bio-Ｒad公司;普通顯微鏡CX41購自奧林巴斯。
1．4細菌培養及血清學鑒定
①將患者腦脊液沉淀接種于無抗巧克力平板，37℃5%CO2進行培養，24h后進行鏡檢和生化鑒定。②將患者血培養瓶置于37℃5%CO2進行培養，15h后取培養液涂于無抗巧克力平板再進行培養，24h后進行鑒定。③將37例密切接觸者的咽拭子接種于雙抗巧克力平板，培養24h，挑取可疑菌落接種于無抗巧克力平板繼續培養，48h挑取無抗巧克力平板上的菌落進行鏡檢和生化鑒定。對確定為腦膜炎奈瑟菌的標本，通過血清凝集試驗進行分群。
1．5基因分型。
1．5．1DNA提取
按照使用說明書，通過MagNAPureLC2．0全自動核酸分離純化系統對患者的腦脊液上清、血液和37例密切接觸者的咽拭子進行DNA提取。
1．5．2引物的合成
引物和探針序列參照文獻［7］，由上海生工生物工程有限公司合成。
1．5．3PCＲ擴增及產物鑒定
使用腦膜炎奈瑟菌屬ctrA基因對患者和密切接觸者提取的DNA進行檢測，再使用流腦分群引物對陽性標本進行分群。熒光定量PCＲ反應體系:PremixExTaq(2×)10μL，上下游引物、探針各1μL，DNA模板2μL，dH2O補足20μL體系。以分別含有ctrA基因、C群特異性基因和B群特異性基因的DNA為陽性對照，dH2O為陰性對照。PCＲ反應程序:95℃2min，95℃5s，60℃20s，共40個循環，在60℃收集熒光信號。Ct值≤35判定為陽性。
1．5．4多位點序列分型引物的設計
參照PubMLST網站上公布的腦膜炎奈瑟菌7個保守基因(abcZ、adk、aroE、fumC、gdh、pdhC、pgm)的引物信息(http://pubmlst．org/neisseria/info/primers．shtml)。PCＲ擴增之后進行測序，測序結果上傳到PubMLST數據庫進行分析［2］。
1．6密切接觸者的抗體水平
按照試劑盒說明書，用A群和C群流腦多糖抗體IgGELISA檢測試劑盒對37例密切接觸者的血清進行流腦A群和C群抗體水平檢測。標準曲線以標準品質量濃度值為x軸，以標準品A450nm值的對數值為y軸，通過四參數Logistic曲線擬合建立標準曲線，根據待測樣品的A450nm值回算相應的質量濃度值。質量濃度≥2μg/mL則為陽性，具有免疫保護水平。
1．7統計學分析
采用IBMSPSS19．0軟件對37例密切接觸者流腦A群和C群抗體水平進行Fisher精確檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。
2.結果
2．1細菌培養和鑒定鏡檢及生化鑒定
結果顯示，患者的腦脊液、血液和13號密切接觸者的咽拭子標本均培養出腦膜炎奈瑟菌，其他36份密切接觸者的標本均未見腦膜炎奈瑟菌生長。血清凝集試驗結果顯示，患者的腦脊髓液和血液均與C群血清凝集，13號密切接觸者的咽拭子與B群血清出現凝集。
2．2基因分型
對于ctrA基因，患者腦脊液、血液和13號密切接觸者擴增的Ct值分別為21、24和25;對于C群特異性基因，患者腦脊液和血液擴增的Ct值分別為24和26，13號密切接觸者未擴增出曲線;對于B群特異性基因，13號密切接觸者擴增的Ct值為28，患者腦脊液和血液均未擴增出曲線。這表明患者為C群腦膜炎奈瑟菌，13號密切接觸者為B群腦膜炎奈瑟菌，與血清凝集試驗結果一致。多位點序列分型結果顯示，患者為ST4821型，13號密切接觸者為ST5664型，兩者均屬于ST4821克隆群。
2．3密切接觸者的抗體水平
A群流腦抗體陽性率較高，達91．89%，平均質量濃度為6．50μg/mL;C群流腦抗體水平陽性率相對較低，為21．62%，平均質量濃度為1．73μg/mL。A群抗體水平高于C群，差異具有統計學意義(P＜0．01)。
3.討論
河南省某校的這起流腦事件根據患者的臨床癥狀、流行病學調查以及實驗室檢測結果，可以確定是一起流腦疫情。對于腦膜炎奈瑟菌的鑒定，PCＲ與細菌培養相比，具有快速、靈敏度高、通量高等多種優點，能夠在短時間內對疑似病例進行檢測。另外，當患者使用大量抗生素之后，細菌培養可能無法培養出致病菌，會嚴重影響實驗結果。而PCＲ技術，只要患者體內存在腦膜炎奈瑟菌特異性核酸基因，就可以完成檢測。研究通過細菌培養和PCＲ兩種方法對患者和密切接觸者的標本進行鑒定，兩者試驗結果表明，患者腦脊髓液和血液標本分離的菌株為C群腦膜炎奈瑟菌，密切接觸者咽拭子標本分離的菌株為B群腦膜炎奈瑟菌。ST4821克隆群是中國首次出現的一個高致病性序列群，其中包含有多個ST型。通過MLST可以對腦膜炎奈瑟菌進行分子分型［6］。本研究中MLST分型結果顯示，患者腦脊髓液和血液標本分離的菌株為ST4821型;其密切接觸者咽拭子標本分離的菌株為ST5664型，這與患者致病菌遺傳關系相近，同屬于ST4821克隆群。通過流行病學調查發現，密切接觸者包括患者的同班同學、父母、親戚和鄰居朋友近期都未出現發熱、頭疼等癥狀。當地近期也未出現流腦病例。但是患者發病前在流腦一個最長潛伏期(10d)內的外出史不詳，無法確定其是否與流腦病人或健康帶菌者有過接觸。因此，這起流腦疫情并沒有發現確切的傳染源，可能與外出有關。研究通過對37例密切接觸者A群和C群抗體進行檢測，發現A群抗體陽性率較高(91．89%)，平均質量濃度為6．50μg/mL，具有免疫保護水平;C群抗體水平陽性率較低(21．62%)，平均質量濃度為1．73μg/mL，低于免疫保護水平，保護力較差，這也是導致這次突發C群流腦疫情的一個重要因素。因此，需在該地區加強A+C群流腦疫苗的接種，以提高C群流腦的免疫水平，同時也需加強對流腦發病趨勢的監測，有效預防流腦的暴發。