流式細胞儀檢測細胞凋亡：PI單染色法

一、基本原理

其原理主要是根據細胞凋亡時在細胞、亞細胞和分子水平上所發生的特征性改變。這些改變包括細胞核的改變、細胞器的改變、細胞膜成分的改變和細胞形態的改變等，其中細胞核的改變最具特征性，主要包括以下幾個方面：

1、細胞核的改變

由于凋亡細胞核的改變，造成各種染色體熒光染料對凋亡細胞DNA可染性發生改變。研究表明，用各種染色體熒光染料對經固定的凋亡細胞進行染色，其DNA可染性降低。許多學者把這種DNA可染性的降低認為是凋亡細胞的標志之一。

2、光散射特性

凋亡細胞形態上的改變影響它們的光散射特性。在流式細胞儀上，前散射光與細胞的大小有關，而側散射光反映的是光在細胞內的折射作用，與細胞內的顆粒多少有關。在細胞凋亡時，細胞固縮，體積變小，故前散射光降低，這一特性往往被認為是凋亡細胞的特點之一。此外細胞凋亡時由于染色體降解，核破裂形成，細胞內顆粒往往增多，故凋亡細胞側散射光常增加。細胞壞死時，由于細胞腫脹，其前散射光增大；側散射光在細胞壞死時也增大，因此可根據前散射光和側散射光區別凋亡細胞和壞死細胞。但需要注意的是，根據前散射光和側散射光判斷凋亡細胞的可靠性受被檢測細胞形態上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此在某些淋巴細胞凋亡中，用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好，而在腫瘤細胞凋亡中，其可靠性就較差。根據光散射特性檢測凋亡細胞最主要的優點是可以將光散射特性與細胞的表面免疫熒光分析結合起來，用以區別經這些特殊處理發生選擇性凋亡的淋巴細胞亞型。也可用于活細胞的分類。

二、試劑與儀器

1、PBS溶液

2、PI染液：將PI溶于PBS（pH7.4）中，終濃度為100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存

3、70%乙醇

4、400目篩網

5、流式細胞儀

三、實驗步驟

1、收集細胞｛數目約（1~ 5）×106個/mL｝，500~ 1000 r/min離心5min，棄去培養液。

2、3ml PBS洗滌1次。

3、離心去PBS，加入冰預冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小時。

4、離心棄去固定液，3mlPBS重懸5min。

5、400目的篩網過濾1次，500—1000r/min離心5min，棄去PBS。

6、用1ml PI染液染色，4℃避光30min。

7、流式細胞儀檢測：PI用氬離子激發熒光，激光光波波長為488nm，發射光波波長大于630nm，產生紅色熒光分析PI熒光強度的直方圖也可分析前散射光對側散射光的散點圖。

8、結果判斷：在前散射光對側散射光的散點圖或地形圖上，凋亡細胞與正常細胞相比，前散射光降低，而側散射光可高可低，與細胞的類型有關；在分析PI熒光的直方圖時，先用門技術排除成雙或聚集的細胞以及發微弱熒光的細胞碎片，在PI熒光的直方圖上，凋亡細胞在G1/G0期前出現一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強度為1.0，則一個典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒光強度為0.45，可用雞和鮭魚的紅細胞的PI熒光強度做參照標準，兩者分別為0.35和0.7，可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞。

四、注意事項

細胞凋亡時，其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結構的改變使其與染料結合的能力發生改變所致。在分析結果時應該注意。