植物基因轉化技術

相關知識
植物基因轉化技術是指將外源基因導入植物細胞或組織，獲得轉基因植物的技術。
植物基因轉化技術總體上可分為兩大類：1 以生物體為介導的基因轉移法；2 DNA直接導入法。前者如農桿菌介導法，植物病毒介導法；后者如基因槍法、電擊法、聚乙二醇法、脂質體法及花粉管通道法。其中應用最廣的是根癌農桿菌介導法。
農桿菌介導法是將含有Ti質粒的農桿菌與組織培養的植物細胞或受傷的組織共培養，使外源基因進入細胞。轉化的細胞在一定的培養基中可以再生出轉基因植株。農桿菌介導的遺傳轉化系統兩種：雙元載體系統和共整合載體系統。雙元載體系統需要兩個彼此分離的質粒，一個是多功能克隆載體質粒，在大腸桿菌和農桿菌中都能復制。它應具備以下三個特點：（1）在其T-DNA末端序列內含單一克隆位點和植物選擇標記基因；（2）T-DNA區以外含有細菌選擇標記基因，以便選擇轉化菌株；（3）可以由大腸桿菌遷移到土壤農桿菌中。另一個是Ti衍生質粒，能提供反式的毒性區功能，以便T-DNA轉移到植物中去。

無論是雙元載體系統還是共整合載體系統，把中間載體質粒由大腸桿菌轉移到土壤農桿菌中都需要三種細菌參與，通常稱為三親交配法。土壤農桿菌轉化植物體的方法有多種。應用最廣泛的是葉盤法。葉盤法非常簡單：首先將葉片消毒，切成小塊，與土壤農桿菌共培養一段時間，轉到含有抗生素的選擇培養基上。非轉化細胞被抗生素殺死，轉化細胞則在2-3周內長出愈傷組織和幼芽。

試劑儀器
含目的基因共整合載體或雙元載體的根癌農桿菌
煙草幼苗
70%乙醇
0.1% 升汞
細菌液體培養基（pH 7.0）
共培養培養基(MS+1.0mg/L6-BA +0.1mg/LIAA)
選擇培養基(MS+1.0mg/L6-BA +0.1mg/LIAA+l00mg/L Km+500 mg/mL Carb)
生根培養基(1/2 MS+100mg/L Km + 250 mg/L Carb)

搖床
分光光度計
恒溫培養箱
保鮮膜、培養皿、剪刀、鑷子、手術刀、小三角錐瓶

實驗步驟
1．農桿菌培養：
（1） 挑單菌落接種到20 mL添加相應抗生素的細菌液體培養基（pH 7.0）中， 27度，180 rpm培養至OD600為 0.6-0.8。
（2） 取少量上述菌液，轉入無抗生素的細菌液體培養基（pH 7.0）中，27度, 180 rpm培養至OD600為 0.2-0.5時即可用于轉化。
2. 無菌受體材料的準備：
取煙草幼苗的葉片，蒸餾水沖洗1次，70%乙醇洗45秒，0.1%升汞消毒6-8分鐘，無菌水沖洗5次，吸干。
將無菌葉片剪成 0.5 cm×0.5cm的小塊，放在菌無小培養皿。
3. 侵染：
將菌液倒入上述無菌小培養皿，幾分鐘后取出葉片，吸去附著的菌液。
共培養：接種于共培養培養基上，25℃、黑暗培養2天。
選擇培養：轉移到選擇培養基上25℃光照(每天16小時光照， 8小時黑暗)培養，每隔15天轉移到新鮮的選擇培養基上。
生根培養：待煙草芽長到4-5片葉時，從愈傷組織上切下煙草芽，轉移到生根培養基上，15天后轉移到新鮮的生根培養基一次。待根系發達后，小心取出帶根系的煙草苗，盡量洗去粘附在根系上的培養基，移栽到土壤中．開始2-3天用保鮮膜保濕。