梨樹農桿菌轉化體系的建立

實驗概要

    以西洋梨豐產為試材建立農桿菌轉化體系，將抗真菌γ-硫堇蛋白Rs-afp₁基因轉入梨離體葉片獲得了抗病的轉化植株。
 

主要試劑

1. YEB（5.0g/L牛肉胨，5.0g/LDifco Bacto提取物，1.0g/L酵母提取物，5.0g/L蔗糖，15g/L瓊脂，50mg/L卡那霉素，pH值7.2。）培養基

2. Carb和Cef（醫用，購自北京經科化學試劑公司，用無菌水配成500mg/ml母液，-20^oC保存。）

3. Kan（購自北京經科化學試劑公司，用無菌水配成10mg/ml的母液，過濾滅菌后-20^oC保存。）

實驗材料

1. 西洋梨豐產

2. 抗真菌γ-硫堇蛋白Rs-afp₁基因

3. pGV雙元載體

實驗步驟

1. 載體構建

    抗真菌γ-硫堇蛋白Rs-afp₁基因是以從蘿卜萌發的種子中提取的DNA為模板，經PCR擴增后的產物。其引物是：
                                Rs-1：5’-TATCTAGAATCATGGCTAAGTTTGC-3’
                                                                Rs-2：5’-TAGAGCTCATCT TATTATCCGTG-3’
        擴增產物的核苷酸序列包括編碼Rs-afp₁的前原肽、單個內含子和終止子。構建嵌合基因所用的啟動子為綠色組織特異表達的菠菜核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）的激活酶（activase）。以uidA（gus）為報告基因，將構建好的基因克隆到pGV雙元載體內，然后轉移到YEB培養基上，每兩個月更換一次新鮮培養基。

2. 菌株培養與離體葉片感染

    農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105在液體YEB培養基中生長一晝夜（200r/min）。離心提取細菌后，在添加AS 20μM的液體再生培養基中洗滌懸浮，最后將農桿菌稀釋至OD₅₅₀為 0.4左右。將切割好的外植體侵入菌液中，放置30min，取出后轉移到與懸浮農桿菌相同的液體培養基中共培養。

3. 轉化體的篩選與植株再生

    取出共培養后的外植體，用添加500mg/L Carb的無菌水沖洗干凈表面的農桿菌，然后轉移到不加Kan的再生培養基上進行預篩選，結束后轉移到添加Kan 25mg/L的分化培養基上，誘導分化產生不定芽。整個篩選過程中，每隔兩周更換一次新鮮培養基。

4. 檢測

    選取抗Kan的新梢，在附加Kan25mg/L的增殖培養基上快繁；取轉基因植株和對照植株的幼嫩葉片接種在含有Kan25mg/L的再生培養基中；在1/4 MS（KNO₃）   IBA 0.3 mg/L   Kan 20 mg/L  蔗糖2％的培養基上生根。其它培養基都附加蔗糖3％，pH5.6，培養條件同常規培養。再生植株的葉片用X-Gluc染色。染成藍色的再生植株葉片和對照植株葉片采用CTAB法提取總DNA，進行PCR檢測。提取質粒，用SstⅠ及XbaⅠ從質粒上切下一段帶Rs-afp₁目的基因的片斷作探針模板，用³²P放射性同位素標記，進行電泳、轉膜和雜交、放射自顯影。