核酸提取那些事兒

最近有篇報道“Nucleic acid purification from plants，animals and microbes in under 30 seconds”即利用試紙條30秒內純化動物、植物和微生物的核酸，發表在PLoS Biology期刊上，引起熱議，故對現核酸提取擴增盡己所能進行總結。

核酸分為核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩大類。這兩類核酸有某些共同的結構特點與相似的理化特性。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離核酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達40g/L，DNA鈉鹽在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩定。

核酸提取前提需進行核酸裂解釋放，經典的裂解液幾乎都含有去污劑 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和鹽 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。鹽的作用，除了提供一個合適的裂解環境 (如 Tris)，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞 (如 EDTA)、維持核酸結構的穩定 (如 NaCl) 等。去污劑則是通過使蛋白質變性，破壞膜結構及解開與核酸相連接的蛋白質，從而實現核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶，利用蛋白酶將蛋白質消化成小的片段，促進核酸與蛋白質的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸，也有直接使用高濃度的蛋白質變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的。

在細菌、植物等富含多糖樣品的基因組抽提中，裂解液中常含 CTAB ，CTAB 的質量對裂解效率有很大的影響，洗滌去除 CTAB 要比其它的鹽難一些，同時，CTAB 的少量殘留也會對酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關鍵；質粒抽離一般采用SDS 堿裂解法；高濃度蛋白質變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法，替代傳統抽提 RNA 的首選方法，傳統的trizol結合氯仿，對人體損傷較大，漸漸被棄用。

        PCR 模板的簡易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法，正如文獻報道：將葉子組織浸入到含有500μl細胞裂解液（20 mMTris [pH 8.0]， 25 mMNaCl， 2.5 mM EDTA， 0.05% SDS）和兩個滾珠的試管中。再把試紙條浸入到葉子組織的粗提液中來結合核酸，隨后又讓它浸入到清洗液中（10 mMTris [pH 8.0]， 0.1% Tween-20），最后將它浸入到擴增反應液中，從而結合到它上的核酸洗脫下來，并將擴增反應液轉移到一臺熱循環儀中進行擴增反應。該方法的特點是無須純化，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非常快速。同時由于不純化，往往含有大量抑制 PCR 的物質，比如牛奶中含有較多乳鐵蛋白，全血 ( 或血清、血漿 ) 中含有大量免疫球蛋白、血紅蛋白、亞鐵血紅素，土壤中含有較多腐殖酸等。這些物質會強烈抑制 DNA 聚合酶的活性，使 PCR 失效，導至假陰性 (即沒有擴增出來的陽性) 比例也比較高。為了提高檢出率需要加入高耐受 DNA 聚合酶 (AlphaTaq)及多種PCR增強劑。該方法最簡單的就是反復凍融法，簡便快捷，不需任何化學試劑，凍融離心，PCR檢測就可以了。如果使用裂解法，哪么最簡單的裂解液就是水，復雜一點的就會含有一些不會抑制后續的 PCR 反應，而且能提高裂解效率，甚至還可能部分消除樣品內抑制 PCR 反應雜質的東西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再復雜一點的就會含有諸如 Chelex 100 之類的能吸附部分雜質的介質。操作也非常簡單，多使用溫度的變化來實現樣品的裂解，如煮沸、或者高溫-低溫的多次循環等，能大大減少操作步驟，大幅度提高檢測速度，節省成本。