有望利用ABE治療單基因突變肝病患者

　　可編程CRISPR-Cas核酸酶通過在目標位置使雙鏈DNA斷裂來實現基因組編輯，但在有絲分裂后的細胞中十分低效。而堿基編輯器是最近開發的基因組工程工具，能在轉換率低的組織中進行精確有效的編輯。

　　對于堿基編輯的臨床應用，其主要的局限性在于產生潛在的非靶突變。非靶突變可以是單導向RNA (sgRNA)依賴的或sgRNA獨立的，并受堿基編輯器表達水平和持續時間的影響。此外，體內堿基編輯尚未在大型動物模型中得到證實。

　　2021年5月19日，瑞士蘇黎世聯邦理工學院Gerald Schwank與加拿大Acuitas治療公司Sean C. Semple團隊合作，在國際學術期刊《自然-生物技術》雜志上在線發表了題為“In vivo adenine base editing of PCSK9 in macaques reduces LDL cholesterol levels”的文章，研究表明在獼猴體內對PCSK9進行腺嘌呤堿基編輯可降低低密度脂蛋白（LDL）水平。

　　DOI: 10.1038/s41587-021-00933-4

　　PCSK9，主要在肝臟中表達，是LDL受體的負調節因子。研究人員用腺嘌呤堿基編輯（ABE）在小鼠Hepa細胞中定位了幾個典型的PkcK9剪接位點來試圖降解PkcK9的mRNA和蛋白質，最后確定了sgRNA_mP01和sgRNA_hP01分別用于小鼠和食蟹猴的體內實驗。并且通過將不同的SpCas9-TadA構建體與sgRNA_mP01一起導入小鼠的肝臟，實驗表明其血漿Pcsk9水平以及血漿LDL水平顯著降低。并且在小鼠中誘導了高達67%的編輯(平均61%)，在獼猴中誘導了高達34%的編輯(平均26%)。小鼠血漿PCSK9和LDL水平分別穩定降低95%和58%，獼猴穩定降低32%和14%。

　　小鼠肝臟中Pcsk9基因的體內腺嘌呤堿基編輯

　　隨后，研究人員探究了長期ABE表達產生的非靶突變，在分子水平評估了在DNA和RNA中的非靶突變。實驗表明ABE mRNA的非靶效應是暫時的，在注射后第17天就不再檢測到，而在基因組DNA中也未發現靶外突變。這些結果表明腺嘌呤堿基在體內編輯是有效和安全的，并有可能用于遺傳性肝病患者的治療目的。

　　Pcsk9的體內腺嘌呤堿基編輯不會在DNA中誘導大量的非靶突變

　　最后，作者為了進一步評估ABE在臨床相關大動物模型中的可行性，在成年食蟹猴(食蟹猴)中編輯了PCSK9。實驗表明，獼猴的ABE可抑制PCSK9從而降低血液LDL。而且與小鼠實驗不同的是獼猴中觀察到SpCas9和TadA的特異性IgG抗體，說明產生了對ABE的體液免疫反應，這可能也是獼猴中的再給藥沒有增加編輯的原因。

　　獼猴肝臟中PCSK9基因座的體內腺嘌呤堿基編輯

　　總之，本片文章研究了小鼠和食蟹猴肝臟中ABEs降低血液低密度脂蛋白(LDL)水平的有效性和安全性。利用脂質納米顆粒實現ABE編碼基因和靶向PCSK9（LDL的負調節因子）單向導RNA的遞送，這在小鼠中可實現高達67％的堿基編輯（平均61％）水平，在獼猴中也可實現高達34％的編輯（平均 26％）效率。

　　血漿PCSK9和LDL的含量在小鼠中分別穩定降低了95％和58％，在獼猴中分別降低了32％和14％。ABE mRNA可被迅速清除，并且在基因組DNA中未發現脫靶突變。對獼猴進行重新給藥并未增加編輯，這可能是由于治療后對ABE產生的體液免疫反應所致。這些發現都為進一步利用ABE治療單基因突變肝病患者提供了支持。