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  • 發布時間:2019-04-11 17:25 原文鏈接: 技術和方案21EMS誘變

    實驗步驟

    1.培養酵母細胞過夜,使細胞密度達到 2X108 個/ml。

    2.從同一培養物中轉移兩份 lml 的樣品至離心管中,5000 g,離心 10s 收集細胞。

    3.丟棄上清,用無菌蒸餾水懸浮細胞,再離心收集細胞。

    4.重懸細胞在 1 ml 的無菌 0.1mol/L 磷酸鈉中。

    5.用血球記數板測定細胞密度。

    6.向其中一離心管中加入 30^x1EMS 并劇烈振蕩分散(另一管作為未誘變的對照)。兩份樣品在 30°C 溫育 lh,不時晃動。

    7.離心收集細胞,棄上清至 EMS 廢液收集瓶中。重懸細胞在 200ul 的 5% 硫代硫酸鈉溶液中,轉移至新的離心管中并將使用過的離心管丟棄至 EMS 廢液收集瓶中。

    8.用 200|ul 的 5% 硫代硫酸鈉溶液洗細胞兩次(廢液棄至 EMS 廢液收集瓶中),重懸細胞在 lml 的無菌水中。

    9.細胞可以直接涂布平板,但在有些情況下讓細胞在選擇培養基上生長之前先生長一段時間十分重要,這樣能使細胞內的野生型蛋白能夠被已誘變的蛋白取代。如果菌落形成后,切記 EMS 誘變處理會導致產生一致的菌落。

    >注意:此方案會使大部分二倍體菌株 40%?70% 的細胞死亡,但是對誘變劑的敏感性是隨菌株不同而變化的。在誘變過程中存活的細胞相對于未誘變的對照細胞通常突變頻率會增加 102~103(Lindegren et al.1965),建議通過預實驗校正 EMS 誘導的死亡率和突變頻率。有一些簡單的測試能夠分析突變頻率,也許最有效的方法就是分析 CAM 基因的功能缺失。CAM 基因功能缺失能使細胞對刀豆氨酸產生抗性(Whelan et aL 1979),因此可將 EMS 處理后和未處理的培養物涂布在含有刀豆氨酸的平板(附錄 A) 上,從而分析對刀豆氨酸抗性的細胞。另一種方法就是檢測因特定基因的失活而產生抗放線酮的細胞(Kaufer et al.1983)。放線酮抗性幾乎都是由于 CYH2 基因的特異性顛換造成的,但是這種突變并不是全部因為誘變(如 EMS 誘變)所造成,因此這種方法并不普及。其他常用的分析誘變的方法是基于一個或多個基因的失活導致產生突變的表型,這包括產生對 5-FOA 的抗性(URA3,URA5 或其他可能涉及滲透性的基因;Boeke et al.1986),能在以 a-氨基乙二酸為唯一氮源的培養基上生長(LYS2 或 LYS5 基因功能缺失;Chattoo et al.1979) 以及產生紅色的菌落(ADEI 或 ADE2 基因功能缺失;Jones and Fink 1982)。

    展開 


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