我科學家用CRISPR獲得轉基因山羊

　　CRISPR/Cas9系統的最新研究進展，提供了一種精確而靈活的方法，可在不同物種中進行基因組編輯。然而，這種方法在大型動物模型（如山羊）中的適用性和效率，還沒有得以廣泛的研究。最近，來自西北農林科技大學、榆林學院、南京大學和上海科技大學等處的研究人員，在Nature子刊《ScientificReports》發表題為“Generationofgene-modifiedgoatstargetingMSTNandFGF5viazygoteinjectionofCRISPR/Cas9system”的研究論文，通過將靶定MSTN和FGF5基因的Cas9mRNA和sgRNA，向單細胞階段受精卵的共注射，成功制備了一個或兩個基因修飾的轉基因山羊。

　　西北農林科技大學動物科技學院的陳玉林教授、榆林學院的屈雷博士、南京大學模式動物研究所黃行許教授和西北農林科技大學動物醫學院的馬保華教授，是本文共同通訊作者。

　　基因組編輯技術依靠使用工程核酸酶，來誘導細胞DNA修復機制，并在不同系統引入可編程的、位點特異性的遺傳修飾。這些可編程的核酸內切酶包括鋅指核酸酶（ZFNs）、轉錄激活因子樣效應核酸酶（TALENs），以及最近開發的CRISPR/Cas9系統。CRISPR/Cas9系統采用短的、單向導RNA（sgRNA），識別靶DNA。與ZFN和TALEN相比，RNA引導的CRISPR/Cas9系統因其靈活、穩健的優勢，已被用于不同物種的基因組編輯，包括模式生物、以及農作物和對農業非常重要的動物。

　　山羊作為第一批馴養的農場動物，是最重要的家畜品種之一，可提供各種產品，包括纖維、牛奶、肉類和皮革制品。此外，山羊也被用作生物醫學研究的模型。雖然研究人員已在山羊中建立了特定的基因敲除策略（基于同源重組HR和體細胞核移植SCNT），但是，山羊基因組的精確基因修飾，仍然是具有挑戰性的。在以往的研究中，研究人員通過CRISPR/Cas9介導的方法，同時破壞山羊初級成纖維細胞的四個基因，只獲得了肌生成抑制蛋白（MSTN）基因敲除的成纖維細胞，并通過SCNT產生了活產山羊。然而，抗生素選擇標記盒，對于從種子供體細胞分離單細胞群落，通常是至關重要的，而且重建胚胎有較低的發育潛能，從而導致相對較低的SCNT打靶效率。Cas9

　　mRNA和sgRNA到單細胞階段胚胎的共注射，已被證明是產生轉基因小鼠、大鼠、猴和豬的一種有效方法，這將激勵我們將這種策略應用到山羊的基因打靶中。

　　在這項研究中，研究人員將靶定兩個功能基因（MSTN和FGF5）的Cas9

　　mRNA和sgRNAs，共注射到單細胞階段的胚胎中，成功地產生了一個或兩個基因被修飾的轉基因山羊。在體外培養的原代成纖維細胞中，MSTN和FGF5的打靶效率高達60%，而在98只試驗動物中，MSTN和FGF5的修飾效率為分別為15%和21%，雙基因修飾的效率為10%。研究人員對成纖維細胞、以及建立者動物和死亡動物的身體組織和睪丸中靶基因的打靶和脫靶突變進行了詳細分析。結果表明，他們在大型動物中同時獲得了幾個位點的編輯，從而表明CRISPR/Cas9系統有潛力成為一種強大而高效的農業動物基因工程工具，因此用于繁殖將是極為重要和適用的。