張鋒NatureMedicine綜述：基因編輯技術最新進展

發布時間：2015-02-10 14:45 原文鏈接：張鋒NatureMedicine綜述：基因編輯技術最新進展

　　人體內已命名的基因共有25000多條，目前已知一部分基因（3000）的突變會引起各類疾病。對于此類疾病的治療，最本質的手段是通過一些方法將突變后的遺傳物質矯正回原來的狀態。這類方法被稱為遺傳療法（genetic therapies）。目前最廣泛的遺傳療法手段為：1. 以病毒載體感染方式引導的源基因導入；2. 以RNA干擾方式引導的目的基因表達下調。這些手段在治療嚴重復合型免疫缺陷疾病（SCID）以及Wiskott-Aldrich綜合征方面獲得了成功。盡管如此，RNAi技術在應用的廣泛性上還存在局限。

　　基因編輯技術（genome editing technologies）是針對DNA本身進行的操作手段。最近應用型基因編輯領域的"鼻祖"，美國麻省理工學院張鋒教授等人發表在《Nature Medicine》雜志上的一篇綜述詳細介紹了這些技術的原理以及在臨床上的應用前景。

　　基因編輯技術的基本原理

　　歸巢酶，ZFN，TALEN以及CRISPR/cas9四種核酸內切酶均能夠特異性地識別與切割特定的DNA序列，引起DNA雙鏈斷裂（DSB）。根據其識別方式的不同可以分為：蛋白質與DNA的識別與切割，包括歸巢酶，ZFN，TALEN； RNA與DNA的識別與蛋白質介導的切割，即CRISPR/cas9。在特異性方面，歸巢酶具有一個較大的DNA識別結構域，此結構同時負責DNA的切割；ZFN與TALEN是由多個酶亞基組成的復合體，分別具有特異性識別DNA的能力與 DNA內切活性。在應用方面，歸巢酶及ZFN需要通過人工突變的方式構造切割不同DNA序列的工程酶，LALEN則需要復雜的分子克隆達到此目的。與之不同，在CRISPR/cas9系統中，可以通過簡單的sgRNA的變化達到切割不同的基因片段的目的。切割完成后，目的位點會出現雙鏈斷裂（DSB）的結果并引起生物體的主動修復。NHDJ修復以另外一條未被切割的DNA鏈為模板，從而保證修復結果的準確。在反復不斷地斷裂-修復過程中，容易在切割位點造成插入或缺失突變，這樣就達到了造成基因紊亂的目的。另外，研究人員利用HDR的修復機制可以人為制造想要得到的突變結果，從而達到基因修復的效果。

　　基因編輯療法簡介

　　基因編輯在疾病治療方面的應用模式主要為：矯正/沉默有害突變，插入保護性突變，加入治療性基因以及敲除病毒DNA。對于突變引起的有害基因的活化，可以通過簡單的沉默或敲除的方式達到治療的目的，如亨廷頓氏舞蹈癥（一種顯性突變引起的家族性遺傳病），但是對于突變引起的正常基因的失活，則需要通過HDR的方式對目的序列進行編輯，使其恢復到原有的健康狀態，如泰薩氏病（一種隱性基因突變引起的遺傳性疾病）。

　　基因編輯的效率

　　基因編輯的效率受到編輯方式，細胞類型，位點序列等多個因素的影響。總體上來講，NHEJ要比HDR效率更高。對于我們更關心的HDR方式，主要受到4個因素的影響：1，修飾的本質，如改變的序列幅度；2，其識別特異性的干擾，如NHEJ可能干擾DSB造成的針對HDR的特異性序列，造成其效率的下降；3，破壞序列與改造序列的相似度；4，HDR拓撲結構。

　　具體治療手段與成功案例

　　目前常見的治療手段為體外治療與體內治療。體外治療為將病人體內需要被改造的細胞取出，在體外進行培養與改造，然后將改造后的細胞導入體內；體內治療為直接將改造材料注入患者體內，可以是系統性地改造，也可以是局部的改造。體外改造的成功例子是講HIV攜帶者體內的CD4陽性T細胞表面的CCR5受體進行突變，然后導入體內，發現這一做法能夠有效提高患者CD4陽性T細胞數量與減輕HIV惡化程度。體內感染的成功例子是對于小鼠B型血友病的治療，通過體內導入重組因子IX，小鼠病情得到了減輕。

　　雖然目前基因編輯編輯技術在安全性與效率方面取得了很大的進步，但是在臨床應用方面還有很大的挑戰。我們需要一方面不斷提高基因編輯的效率，以期能夠以最小的代價得到有效治療；另外，我們還需要不斷探索這些核算內切酶的作用機制，從而能夠進一步提高它們的特異性，將副作用降到最低。