建立“人造精子”介導高效產生點突變小鼠的新方法

　　近日，中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所李勁松研究組和第二軍醫大學附屬長征醫院袁文課題組的最新研究成果Efficient generation of the mouse model with a defined point mutation Through haploid cell-mediated gene-editing在線發表在Journal of Genetics and Genomics上。該研究結合CRISPR-Cas9基因編輯技術和半克隆技術，實現了點突變小鼠的高效制備。

　　建立點突變小鼠模型，尤其是致病基因點突變的小鼠模型，對研究基因的功能和疾病的致病機制至關重要，但通過傳統的同源重組編輯胚胎干細胞的方法耗時耗力。近年來，通過CRISPR-Cas9直接注射受精卵可獲得到攜帶點突變的小鼠，但產生攜帶點突變小鼠的效率不高且存在個體基因型嵌合的現象。李勁松研究組的前期研究建立了小鼠孤雄單倍體胚胎干細胞（AG-haESCs）及將其注入卵子獲得健康小鼠的半克隆技術（Cell, 2012），進一步優化該技術獲得了能穩定高效產生半克隆小鼠的單倍體干細胞（DKO AG-haESCs，又稱為“人造精子”）（Cell Stem Cell, 2015），為快速制備攜帶目的點突變小鼠模型提供了新方法。研究人員首先采用攜帶點突變的單鏈寡脫氧核苷酸（ssODN，長度為99堿基）作為修復模板與CRISPR-Cas9共同轉入單倍體細胞中，發現隨著目的突變位點與Cas9酶切割位點（即DNA雙鏈斷開位點）距離的增加，同源重組獲得攜帶突變位點細胞的效率急劇下降。當距離≥10bp時，采用ssODN為模板的效率低至無法檢測，無法獲得攜帶這些位點的突變細胞。為此，項目組構建了攜帶點突變的雙鏈載體作為模板（長度為258bp-2.1kb），發現可以顯著提高同源重組效率；同時，發現當載體長度在1-1.5kb時，同源重組效率最高。研究人員進而建立了攜帶點突變的單倍體細胞系，并通過卵子注射高效獲得攜帶目的點突變的小鼠模型。研究人員提出在致病點突變的模擬過程中，當突變位點與DNA雙鏈斷開位點距離＜10bp時，可以選用ssODN為模板；當突變位點與DNA雙鏈斷開位點距離≥10bp時，采用載體作為模板時會有較高的效率。

　　魏磊鑫和王修坤為論文的共同第一作者。研究獲得生化與細胞所細胞平臺和動物平臺的支持和幫助，并獲得中科院、上海市、國家科技部及國家自然科學基金委的經費支持。