應用PCR的遺傳工程

實驗方法原理 本方案（由德克薩斯大學西南醫學中心的 Andereson 提供）敘述在克隆化的哺乳動物 cDNA 的 5' 與 3' 端同時導入限制性內切核酸酶酶切位點，有時在此 cDNA 5' 末端，改變部分密碼子為大腸桿菌的偏愛密碼子等。

實驗材料 限制性內切核酸酶熱穩定 DNA 聚合酶陽性對照 DNA模板 DNA

試劑、試劑盒 擴增緩沖液dNTP 貯存液

儀器、耗材 瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠屏蔽型槍頭離心管或微量滴定板正向排液式移液器PCR 儀

實驗步驟

一、材料

1. 緩沖液和溶液

10X 擴增緩沖液

4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L, pH 8.0)

2. 酶與緩沖液

合適的限制性內切核酸酶

熱穩定 DNA 聚合酶

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠

4. 核苷酸與寡聚核苷酸

寡核苷酸引物 1 與引物 2 均溶于 TE ( 10 μmol/L, pH 8.0)

陽性對照 DNA

模板 DNA

5. 載體

質粒 DNA 應用相應的限制性內切核酸酶消化和凝膠電泳純化

6. 特殊設備

自動微量移液器的屏蔽型槍頭

離心管（0.5 ml, 薄壁擴增反應專用離心管）或微量滴定板

正向排液式移液器

PCR 儀

二、方法

1. 設計與合成預期的末端修改的寡核苷酸引物。

例如，根據 cDNA 模板設計的 5'引物為 5' dATCATATGGCTCTG GATGAACT- GTGCCTGCTGGACATGCT3'，3' 引物為 5' dATAAGCTTTTATTAAGACA-GACTCAGCTCATGGGAGGCAA3'，這樣在 cDNA 的 5' 末端引入了 Nde  I (CATATG) 位點，改變了 cDNA 的部分密碼子為大腸桿菌偏愛密碼子。下面劃線的核苷酸表示寡核苷酸引物與 cDNA 模板之間是不同的。對于寡核苷酸引物 3' 末端完全配對的堿基對數目究竟是要求多少對才能成功擴增靶基因尚無精確定論；然而，具體工作中發現一般有 8~10 對完全配對的堿基對就足夠了。

2. 按以下次序，將各成分加入在 0.5 ml 滅菌離心管，擴增管或滅菌滴定板的孔內，混合：

100 ng 模板 DNA                   10 μl

10X 擴增緩沖液                      5 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液   5 μl

10 μmol/L 引物 1 ( 50 pmol )    5 μl

10 μmol/L 引物 2 ( 50 pmol )    5 μl

1~2 單位熱穩定 DNA 聚合酶    1 μl

H2O 補足至                            50 μl

設置二支對照反應管，加入以上除了模板 DNA 的所有試劑。在其他反應中，加 入包含模板 DNA 的所有以上試劑。通過 PCR 預期會產生陽性結果。試驗管與對照管一同進行所有后續的實驗步驟。

3. 如果 PCR 儀沒有配制加熱蓋，在反應混合液的上層應加一滴礦物油（約 50 μl)，防止樣品在 PCR 反應多個加熱與冷卻的循環過程中蒸發。如果應用熱啟動 PCR 程序，在反應混合液的上層加一層石蠟油。放置離心管和微量滴定板在 PCR 儀上。

4. 按以下方法進行 PCR 擴增。典型的程序有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度列表如下：

5. 抽取每種擴增樣品 5%~10%, 用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析擴增結果，用 DNA marker 來判斷擴增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠）或 SYBR 金顆粒染色后來觀察擴增的量與片段大小。

—次成功的擴增反應應該產生與我們預期大小一致的 DNA 片段。擴增條帶可用 DNA 序列分析，SoutKem 雜交和限制性內切核酸酶酶切圖譜予以鑒定。

6. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內樣品液體的上層（步驟 3)，反應結束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。

7. 為了后續的克隆，對 DNA 擴增片段應用相應的限制性內切核酸酶進行消化（酶切位點由引物的 5' 末端導入，上述例子應用 NdeⅠ和 HindⅢ）。應用凝膠電泳或超濾方法純化酶解片段。

8. 用預期的載體 DNA 建立適當的連接反應，連接反應中插入片段與載體的摩爾比率為 3:1。