小鼠巨噬細胞的分離

基 本 方 案 1 小鼠腹腔巨噬細胞的分離

材料

小鼠，潔 凈 環 境 中 飼 養（最好置層流柜中飼養）

7 3 % (m /V ) 豚 蛋 白 胨 或 者 3 % (W V r) Brewer 硫 基 乙 酸 鹽 肉 湯（Brewerthioglycollate medium，分離炎性腹腔巨嗤細胞用）

7 0 % 乙醇

收集用培養基：含 5 % (v/V ) FBS (Hyclone，無內毒素）的 D M E M (G I B C O /B R L )

Diff-Quik 染液 I、 II 和 III (Baxter)

25 G 針頭

6m l 和 30m l 注射器

鑷 子 和平頭外科剪（浸 于 7 0 % 乙醇中）

19 G 針頭

50m l 聚丙烯錐底塑料離心管，冰上預冷

離 心 機（Shandon/Lipshaw)

細 胞 甩 片 機（Shandon/Lipshaw)

Sorvall R T 6000 離 心 機 及 H l O O O B 轉 子（或替代品）

la. 收集靜息腹腔巨噬細胞時：斷 頭 或 C O 2 窒 息 處 死 小 鼠（附 錄 2 G )

Ib. 收集炎性腹腔巨噬細胞時：用 6m l 注射器吸取 Iml 3 % 豚蛋白胨肉湯。換 用 25 G 針頭將肉湯注入小鼠腹腔（附 錄 2E )。 3d 后斷頭或 C O 2 窒 息 處 死 小 鼠（附 錄 2 G )。 也可腹腔注射 Iml 3 % Brewer 硫基乙酸鹽肉湯， 5?7d 后收集細胞。

2.7 0 % 乙醇消毒小鼠腹部。無菌剪開腹部毛皮，用鑷子夾住腹部毛皮，向兩邊撕開，暴露完整腹膜。

3 . 將 1 9 G 針頭裝在 3 0 m l 注射器上，吸 取 I O m l 收集用培養基。針尖斜面向上，在腹中線 處 刺 透 腹 膜（附 錄 2E ) ，將培養基注入腹腔。為防止刺破腸壁，在針尖穿過腹膜時 ，可推動針筒使少量培養基流經針頭，進入腹腔。

4 . 調整針尖斜面向下，輕輕挑起腹膜，慢 慢 吸 回 腹 腔 灌 洗 液（每只小鼠約 8 ml)。將腹腔灌洗液加入冰上預冷的 50m l 聚丙烯塑料離心管中。

5 . 取 20ul 腹腔灌洗液，計 數（附 錄 3A )。

6 . 取 0. 2m l 腹腔灌洗液加入細胞甩片機中。按說明書， 600r/m i n 離 心 6 min，制備細胞甩片。風干后，進 行 Diff-Quik 染色，并計數。

7 . 將剩余的腹腔灌洗液， 4°C ， 400 g 離 心 lOmin，棄上清，輕彈管底，混勻細胞。加入收集培養基調整細胞至合適濃度。

一 只 小 鼠 可 獲 得 2 X 1 0 6? 3 X 1 0 6 個 腹 腔 細 胞 ， 其 中 巨 噬 細 胞 占 5 0 % ? 7 0 % 。 月示蛋 白 胨 或 硫 基 乙 酸 鹽 肉 湯 腹 腔 注 射 后 小 鼠 ， 每 只 可 分 別 獲 得 3 X IO6? 4 X IO6 個 及 約IO7 個 巨 噬 細 胞 。 這 些 促 炎 劑 可 募 集 新 生 的 、 未 成 熟 巨 噬 細 胞 至 腹 腔 。

基 本 方 案 2 小鼠骨髓巨噬細胞的分離和培養

材 料

小鼠 ，潔 凈環境中飼養（最好置層流柜中飼養）

PBS

淋 巴細胞分 離 液（L S M ; Organon Teknika Cappel)

含添加 物 的 E M E M 和 E M E M -10

小鼠特異性 C S F 或 IL-3 (G e n z y m e )

II 型中性蛋白酶， 1.0m g / m l (BoehringerMannheim)

鑷 子 和 剪 刀（浸 于 7 0 % 乙醇中）

25m l 注射器

26 G 針頭

50m l 聚丙烯錐底塑料離心管，冰上預冷

15m l 聚丙烯錐底塑料離心管

Sorvall R T 6 0 0 0 離心機和 H B 1 0 0 0B 轉 子（或替代品）

25c m 2 和 75c m 2 細 胞 培 養 瓶（Corning)

無菌橡皮細胞刮子

1 . 處 死 小 鼠（附 錄 2 G )。將小鼠后肢的皮毛剝至足部。連同褪下的皮毛剪去雙足。剪下后腿，放入盛有無菌 P B S 的培養皿中。

2 . 鑷子夾住腿骨一端后，用剪刀剔除肌肉。在關節處剪斷腿骨