寡聚脫氧胸苷纖維素純化帶poly(A)+RNA

NaOH.寡聚脫氧胸苷 (oligo(dT) ] 纖維素 DEPC 處理的水 1X 加樣緩沖液 洗脫緩沖液 NaAc(pH5.2) 乙醇 TE 緩沖液。。

一 材料與設備

1 ) 5 mol/L NaOH

2 ) 寡聚脫氧胸苷 (oligo(dT) ] 纖維素

3) DEPC 處理的水

4) 1X 加樣緩沖液：20 mmol/L Tris-CL PH (6.7). 0.5 mol/L NaCl, l mmol/L EDTA( pH 8. 0 ). 0.1% 十二烷基肌氨酸鈉

5 ) 洗脫緩沖液 ： 10 mmol/L Tris-Cl ( PH7. 6 ) ， 1 mmol/L EDTA( PH 8.0) ， 0.05% SDS

6) 3 mol/ L NaAc (pH5.2)

7 ) 乙醇

8) TE 緩沖液


二 操作方法

1) 先用 10 ml5mol/LNaOH 清洗硅化的層析柱，然后用水沖洗。取 0.5 g oligo（df) 纖維素干粉加于 1m]0.1mol/LNaOH 中，倒人柱內，以約 l0 ml 的水沖洗。(層析柱可用硅化的巴斯德吸管堵上已硅化的玻璃棉制成或用容量為 2 ml 的已硅化的一次性柱子

2) 用 10?20℃ 加樣緩沖液平衡柱子，至流出液 pH 約 7.5

3) 于 70℃  加熱含 2 mg 總 RNA 的水溶液 10min，迅速冷卻至室溫，加等體積的 2X 加樣緩沖液，上樣，立即用無菌試管收集流出液。并以一倍柱體積的加樣緩沖液洗滌，將流出液于 70℃ 溫育 5 min，重新上柱 2 次。

4) 用 5?10 倍柱體積的加樣緩沖液洗柱，分步收集洗出液，每份 1 ml，測定每一收集管的 OD₂₆₀。洗脫至 OD₂₆₀ 很小或為零。

5) 用 2?3 倍柱體積的洗脫緩沖液洗脫 Poly(A)ˉRNA，以 1/3?1/2 柱體積分步收集洗脫液。

6）調整所收集的 KNA 溶液的乙酸鈉濃度至 0.3mol/L, 加 2.5 倍體積乙醇，一 20℃放置過夜或干冰/乙醇中 30 min

7) 于 4℃ 10000 g 離心 15mim 沉淀 RNA。棄去乙醇，再用 70% 乙醇洗沉淀. 棄去 70% 乙醇，晾干沉淀，重溶于少量無 RNA 酶的 TE 緩沖液。取在 70℃  加熱 5 min 后，在 1% 瓊脂糖凝膠電泳中檢査 RNA 的質量。

S)poly(A)⁺1RNA 溶液可直接于 70℃ 保存，或加 3 倍體積乙醇保存于-70℃

1 ) 1ml 的 oligo(dT)-纖維素最大載樣量為 10 mg 總 RNA，如果總 RNA 的量較少，應減少 oligo( (dT)-纖維素量 . 以免 poly( A)ˉ RNA 在過柱和后續步驟中損失。同時也避免浪費。

2 ) 加熱 RNA 可以破壞可能的 poly( A)ˉ 尾的二級結構 。

3 ) 從加樣的總 RNA 中可回收約 1%? 2^?  puly(A)ˉ RNA，從 10⁷ 個哺乳動物細胞中可獲得 1?5ug Poly( A)⁺RNA。

4) 電泳檢測 poly( A)⁺RNA 應在 20k h 以下并呈彌散狀 ，且絕大多數集中在 5?10kb 范圍

5 ) 十二烷基肌氨酸鈉較難溶，若室溫低于 18℃ 可能會阻礙柱內液體的流動，可用氯化鋰代替加樣緩沖液中的氯化鈉以解決此問題。