定量SDS凝膠染色與掃描

考馬斯亮藍（CBB) 染色液 脫色液

SDS-PAGE 電泳裝置 凝膠掃描裝置

設備

SDS-PAGE 電泳裝置

凝膠掃描裝置

試劑

考馬斯亮藍（CBB) 染色液

脫色液

(配方，見“試劑的配制”，PP.184~189)

操作程序

1) 小心地在 SDS 凝膠泳道上加一組按量遞增為序的蛋白質樣品，再按同樣順序加一組純蛋白質樣品作為定量的標準。按常規進行電泳（見附錄 5)。

2) 從電泳裝置取下凝膠，置于脫色液中漂洗 1 min 以脫去部分 SDS，再將它浸泡在 CBB 染色液中，于 20°C 緩慢搖動（如在脫色搖床上）。0.75-mm 厚的凝膠需浸泡 lh,1.5-mm 厚的凝膠約需 4 h。

3) 傾出 CBB 染色液，將凝膠浸泡在脫色液中，緩慢搖動1~4 h, 視凝膠厚度而定 (用海綿或 Kimwipe 紙巾吸收游離的染料)。當大部分染料由凝膠擴散出來后, 從容器中取出吸收物，于脫色液中加入 CBB 染色液，使其 A_650nm 值達 0.1(淺藍色)。當時，CBB 的濃度大于它與蛋白質的平均結合系數。凝膠置于此稀染色液中平衡過夜，并保存于其中直至掃描測定。

4) 在 650nm 波長下，掃描經染色和脫色的凝膠，測定各蛋白帶中結合染料的量。

5) 對每條帶，以結合染料量對其加樣量作圖，比較所得直線與標準曲線的斜率, 計算各樣品中目的蛋白的濃度。

6) 對原材料或純化各步祥品的凝膠掃描全程進行積分，計算σ³² 帶中的蛋白質占總蛋白量的比例。
注：此值是純度的最大估計值。通常，在檢測極限下還有許多條帶，如將它們加在一起時就不能忽略了。多數研究者常高估他們的蛋白質制備物的純度。