如何做好熒光定量PCR實驗？（六）

其他問題：

1）、文獻上找到的引物和探針序列能否直接使用？

通常國外的文獻可信度比較高，可直接使用；但為了保險起見，最好用blast對引物探針的序列進行必要的驗證；或者再進一步用primer軟件對引物探針的二級結構和退火溫度進行分析，這樣更有利于您對整個實驗的把握。

2）、在實驗之前要進行哪些準備工作？

首先要不加探針做常規的PCR實驗，驗證引物是否工作、模板是否降解、模板純度是否合適，可以采用《通用PCR Master Mix 試劑盒》來縮短該過程。

3）、標本的采集和處理應該注意什么問題？

根據實驗要求和目的，有針對性采集病灶部位的標本；采集好的標本，最好根據每次實驗用量，用凍存管分成幾小份，放在－80℃保存，以免反復凍融；標本通常分成3類，如細胞組織、分泌物、血清全血；如果是血清，不能有融血現象的發生，否則會影響PCR的擴增；如果是全血，最好不用EDTA作為抗凝劑，選用檸檬酸作為抗凝劑，否則會影響PCR的擴增；如果是組織，最好用蛋白酶K消化；如果是提RNA的標本，更應該防止反復凍融和保持標本的新鮮。

4）、在做熒光定量實驗時要注意些什么呢？

見產品操作注意事項。

5）、如果出現污染該怎么辦？

以替換法確定污染從何而來，對癥下藥，值得注意的是，因熒光定量PCR的敏感度極高，從防止污染的角度出發，最好在體系中加有dUTP，一旦出現污染現象，可以用UNG酶消除；同時將實驗室分成4個區，即試劑儲存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配制、擴增和產物分析區。