大環內酯類能不可逆的結合到細菌核糖體50S亞基上，通過阻斷轉肽作用及mRNA位移，選擇性抑制蛋白質合成。現認為大環內酯類可結合到50S亞基23SrRNA的特殊靶位，阻止肽酰基tRNA從mRNA的“A"位移向”P“位，使氨酰基tRNA不能結合到”A“位，選擇抑制細菌蛋白質的合成；或與細菌核糖體50S亞基的L22蛋白質結合，導致核糖體結構破壞，使肽酰tRNA在肽鍵延長階段較早地從核糖體上解離。由于大環內酯類在細菌核糖體50S亞基上的結合點與克林霉素和氯霉素相同，當與這些藥物合用時，可發生相互拮抗作用。
細菌對大環內酯類會產生耐藥性，本類各藥之間亦有不完全的交叉耐藥。耐藥通常由質粒編碼，機制可能是：
①抗生素進入菌體量減少和外排增加，如革蘭陰性菌可增強脂多糖外膜屏障作用，藥物難以進入菌體；
②金黃色葡萄球菌外排泵作用增強，藥物排出增加，或細菌產生了滅活大環內酯類的酶，如酯酶﹑磷酸化酶及葡萄糖酶；細菌改變了與抗生素結合的核蛋白體結合部位，使其結合能力下降。