一)選擇目標基因
由于多重PCR在同一個反應體系中需要加入多對引物,而模板直接影響擴增的結果分析,這就導致了擴增模板的選擇至關重要。同時,擴增區域的選擇必須符合分析的目的,如通常對于致病微生物,需要選擇其保守序列,如16sRNA,或者毒力基因、毒力相關基因,以防止檢測到非致病突變體而無法解釋結果;對于需要分型的對象來說,需要選擇它們之間有差異的保守序列進行擴增;對于高度同源的序列來說,可以用相同的引物進行擴增,但獲得的陽性結果需要利用特異探針雜交或限制性酶切進行進一步確定;缺失分析選擇擴增外顯子;法醫學鑒定個體差異選擇擴增高度多態性標志;轉基因檢測則選擇轉入的動植物基因座;性別鑒定一般選擇X或Y性染色體上特有的基因座 對于含有多個外顯子的基因缺失分析來說,可選擇缺失熱點較廣區域或缺失密集區域。相鄰近的外顯子可用跨越這兩個外顯子的引物進行擴增。
二)引物設計引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸序列,使其能有效地擴增模板DNA序列。因此,引物的優劣直接關系到PCR的特異性與靈敏度。要確定引物的位置,首先需要知道所選擇的基因引物與模板結合部位的詳細DNA序列信息。在多重PCR中,為了保證擴增效率,所有的引物對必須優化到相近的擴增條件。
因此,多重PCR的引物設計除了要滿足一般PCR引物設計的原則外,還要注意以下幾個問題:
①各引物之間不能互補,尤其避免3的互補,以免形成二聚體,引物設計好以后進行PCR擴增,以檢驗引物之間是否配對形成二聚體;
②各引物與其它擴增片段和模板不能存在較大的互補性,擴增片段之間也不能有較大的同源性;
③對于引物的長 度、(G+C)含量、T值要求盡量一致;
④各引物擴增產物的片段大小要有一定的差別,以便于用電泳的方法進行區分。
一般來說,產物片段越大,其長度的差別也應該越大。這就給多重PCR引物的設計帶來了一定的難度。
三)核酸提取核酸依賴的檢測方法受目標核酸純化的影響,核酸的純化程度決定了核酸方法的應用。
多重PCR的優勢在于快速、系統,主要用于臨床標本的檢測,包括血液、組織、糞便等,同時多重PR對核酸模板的要求比較高,所以核酸的提取純化顯得尤為重要,直接與擴增結果 一般來說,通過煮沸裂解細菌制備模板可以滿足普通PCR反應,但是用于多重PCR反應會存在很多問題。在條件允許的情況下,多重PCR需要以純化的DNA為模板,可以確保多重PCR的順利進行。
四)單位點PCR(也叫單引物PCR)在進行多重PCR之前,必須先對每對引物進行單位點PCR。確定每對引物進行單位點PCR時條件如表1所列
反應完成后比較擴增結果,確保在相同的循環條件下所有的引物都能擴增出對應的產物條帶,以確保引物能夠特異性擴增對應的目標序列。
五)多重PCR(引物等濃度混合)反應體系中各對引物等濃度混合,體系中其它各成分的濃度不變,應用與單位點PCR相同的反應條件進行多位點同時擴增,根據擴增結果對多重PCR反應體系及反應條件進行調整,具體操作如下面所述。
六)優化多重PCR反應體系及反應條件多重PCR的反應體系和反應條件基本與單位點PCR相同,但也不能一蹴而就,必須使多重PCR反應中每對引物對應的靶點都能獲得足夠的擴增量,并且擴增產物之間的產量應該基本影響多重PCR擴增效果的因素可以分為反應體系和反應條件兩大類。其中反應體系包括引物、緩沖液、 Taq DNA聚合酶、dNTP和MgCl2等,反應條件包括退火溫度、延伸溫度、延伸時間,循環數等