多重數字PCR技術介紹（一）

什么是數字PCR？

數字PCR是一種新的絕對定量PCR，通過對PCR反應物進行有限稀釋，隨后在不同的反應腔室里進行PCR擴增，最后根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例得出靶分子的起始拷貝數或濃度的技術。

什么是多重PCR？

多重PCR又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一PCR反應體系里加上兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應；由Chambehian'于1988年首次提出,其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同。理論上只要PCR擴增的條件合適,引物對的數量可以不限,但由于各種條件的限制,實際能夠擴增的引物對數量是有限的。

什么是多重數字PCR？

多重數字PCR是在同一數字PCR反應體系里加上兩對或兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的數字PCR反應。將多重PCR技術與數字PCR技術有機結合而形成的多重數字PCR，根據DNA探針不同熒光度、DNA擴增不同循環數及多種標記熒光同時使用，便可大幅提高數字PCR多重性，多重性可達20-50以上，即同時在一個PCR反應單元內進行20-50個以上的數字PCR反應。

多重數字PCR在醫學檢測中的優勢

在數字PCR中實現多指標的并行檢測能顯著降低檢測成本，獲取更豐富的檢測信息。在一個PCR反應中完成基因多個突變位點的檢測，即一個PCR反應即可完成一個Panel的檢測，在醫學領域有著不可替代的優勢。

其優勢可以簡單概括為以下三點：

1高效性。

在同一PCR反應管內同時檢出多種核酸片段，或對有多個型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體。

2系統性。

多重數字PCR很適宜于成組核酸片段的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌。

3經濟簡便性。

多種核酸片段在同一反應管內同時檢出，節省時間、試劑耗材和經費，為臨床提供更多更準確的檢測信息。

多重數字PCR的檢測類型

數字PCR的多重檢測主要通過以下兩種方式實現：

1、多個熒光通道。使用多種熒光染料來標記不同的要檢測的靶基因。

2、單波長多強度。使用一種熒光染料，但是擴增結束時不同的靶基因對應的染料的熒光強度不一樣。

多重數字PCR在臨床領域的應用舉例：

1.多重數字pcr技術檢測肺癌EGFR基因突變

來源：Mol Med Rep.2017 Aug;16(2):1157–1166

EGFR基因突變位點的檢測是指導非小細胞肺癌患者臨床用藥的依據。其中最常見的是21號外顯子L858R突變，19號外顯子缺失以及20號外顯子T790M突變。但是臨床樣本往往是有限的，尤其是液態活檢樣本，因此多重檢測可以節省大量檢測樣本及檢測成本。

2，多重數字pcr技術在染色體非整倍體篩查中的應用

來源：Analyst.2019 Mar 25;144(7):2239-2247

High-Precision Chromosomal Copy Number Measurement using RainDrop?Digital PCR Application Notes

數字PCR技術具有單分子靈敏度和絕對定量的能力，能夠區分微小差異，很適合用來進行無創產前檢測。由于胎兒游離DNA占孕婦外周血中游離DNA很小一部分，常規實驗一對引物探針要想準確分辨胎兒染色體倍數需要提高足夠多的模板（約41-252ng，胎兒DNA比例10%-4%），這么大量的DNA臨床一般無法提供(1ml血常規只能獲得1-7ng cfDNA)，這時通過多重數字PCR設計40對引物和2個通用探針擴增21號和18號染色體上的各20個片段，就能很好的解決這個問題。結果顯示以10ng cfDNA作為起始模板，使用多重數字PCR技術能夠精準分辨21-三體綜合征。