多囊卵巢綜合征病人基因組DNA甲基化免疫沉淀反應分析

　　多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome, PCOS)是一種復雜的、病因不明的疾病，最新研究結果表明，胰島素耐受(insulin resistance , IR)在PCOS的發生過程中起了重要的作用。本研究主要致力于探究IR在PCOS發生過程中的分子機制，運用基因組DNA甲基化免疫沉淀技術(methylated DNA immunoprecipitation , MeDIP)，分析了正常人與PCOS病人基因組中有差異的甲基化基因，此外，還鑒別了胰島素不耐受的PCOS病人(PCOS-non-insulin resistance , PCOS-NIR)與胰島素耐受的PCOS病人( PCOS insulin resistance , PCOS-IR)差異的甲基化基因。結果表明，PCOS-NIR與PCOS-IR病人有79個差異的甲基化基因，PCOS病人與正常人有40個差異的甲基化基因。研究者通過構建調控網絡以及蛋白-蛋白相互作用網絡來分析這些差異基因，此外，他們還通過GO功能注釋以及通路富集分析來研究網絡的生物學功能。研究者將兩組比較得出的差異的甲基化基因進行分類，經過GO注釋后發現，PCOS-NIR與PCOS-IR病人在免疫應答反應中的甲基化基因有顯著的差異，此外，癌癥信號通路上的基因在兩組中均有顯著的甲基化差異。這篇研究有助于更好的闡明PCOS發生的分子機制。

　　本文是由上海仁濟醫院的狄文教授與蘇州大學神經科學研究所的曹聰教授共同合作完成的，其團隊主要采用MeDIP技術完成了對PCOS疾病的分子機制的研究，該服務由上海生物芯片有限公司/生物芯片上海國家工程研究中心提供。

　　該研究設立了三個組，分別是：PCOS-NIR病人組、PCOS-IR病人組以及正常人組，每組均有五位女性。

　　為了鑒定特異性的DNA甲基化片段，研究者設計了針對含特定甲基化片段的雌激素受體(estrogen receptor beta ,ER-β)基因的引物，進行特殊的PCR (methylation-specific PCR, MSP)，發現所有樣品中甲基化片段大約為250bp左右。 選取ER-β基因是因為該基因與PCOS疾病相關。

　　Figure 1. MS-PCR electrophoretogram showing the specificity of methylated DNA.

　　注：U代表 unmethylated-specific primer，M代表methylated-specific primer

　　通過MeDIP-chip檢測，得到PCOS-NIR與PCOS-IR病人有79個差異的甲基化基因，PCOS病人與正常人有40個差異的甲基化基因。為了獲得與這些基因相關的調控網絡圖，研究者將它們與TRANSFAC以及TRED數據庫進行比對，通過Cytoscape軟件構建出了調控圖譜(Figure2)。從A圖可以看出，在該調控圖中，顯著性差異基因CEBPB通過調控一系列基因形成了一個局部的網絡結構，這也暗示了該基因在PCOS-IR疾病的發生過程中起了重要的作用，此外CEBPB基因還通過調控正常基因CREB1間接調控了甲基化基因ODC1，同時在該網絡中，甲基化基因GART直接調控了甲基化基因GOT1，間接調控了另一個甲基化基因PDE4DIP。相比之下，B圖所呈現出的 PCOS病人與正常人的調控網絡圖則非常簡單，甲基化基因EPM2A調控了兩個正常的基因MYC以及E2F2，甲基化基因ITGA4以及HMGA1分別調控了正常基因ETS1以及IGFBP1。

Figure 2. Regulatory network analysis of differentially methylated genes.

A圖表示PCOS-NIR和PCOS-IR病人差異的甲基化基因的調控網絡

B圖表示PCOS病人于正常人差異的甲基化基因的調控網絡

注：黃色節點代表甲基化的基因，粉紅色的節點代表正常基因

　　為了進一步探究Figure2A中各基因的生物學功能，研究者采用了在線生物學分類工具DAVID，對這些有顯著性差異的甲基化基因進行GO分類，結果表明，最顯著的GO分類富集類型是關于防御反應，其次是炎癥反應，創傷反應以及對細胞因子生成的調節，總體來講，這些反應均與免疫應答相關。

　　對Figure2A中基因的調控通路進行富集分析，采用DAVID工具富集出四條通路，包括：細胞因子受體相互作用通路，造血細胞系通路，哮喘通路以及Jak-STAT信號通路。

　　研究者進一步探究這些甲基化基因在蛋白水平的變化，他們將所得的差異的甲基化基因與HPRD以及 BIOGRID數據庫進行比對分析，構建了蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction , PPI)網絡。據報道，在網絡中處于中心地位的基因較周圍的基因具有更關鍵的細胞學功能。從PCOS-NIR和PCOS-IR病人的PPI網絡圖中，可以發現甲基化基因CEBPB, GOT1, GET4, ODC1 以及C12orf44形成了一個局部的網絡結構(Figure 3A)。在PCOS病人與正常人的PPI網絡圖中，甲基化基因GSK3A, HMGA1, ITGA4,EPM2A以及BAG2成為了中心節點(Figure 3B)。

Figure 3. Protein-protein interaction (PPI) network analysis.

A圖表示PCOS-NIR和PCOS-IR病人的PPI網絡

B圖表示PCOS病人于正常人的PPI網絡

　　為了分析處于PPI網絡結構中的基因的生物學功能，研究者對這些基因分別進行了GO功能注釋。在PCOS- NIR和PCOS-IR病人比對組中，最顯著的GO類型是調控RNA聚合酶II啟動子的轉錄基因，其次是氮類化合物代謝正向調控基因、高分子代謝正向調控基因。在PCOS病人和正常人的比對組中，最顯著的GO類型是正向調控高分子代謝的基因，其次是細胞生物合成正向調控基因，氮類化合物代謝正向調控基因。

　　此外，研究人員還對PPI網絡中的基因進行了信號通路富集分析。在PCOS-NIR和PCOS-IR病人比對組中，6條信號通路被富集出來，主要關于：癌癥、慢性骨髓白血病以及前列腺癌。在PCOS病人和正常人的比對組中，5條信號通路被富集出來，涉及癌癥、 ErbB信號通路以及粘著斑。