(1)樣品制備和標記 為了獲得目的基因的雜交信號必須對目的基因進行標記,由于目前常用的熒光檢測系統的靈敏度還不夠高,為了提高檢測靈敏度,需要在對樣品核酸進行熒光標記時,對目的基因進行擴增。生物樣品成分復雜,往往含有較多的抑制物,在對樣品進行擴增、熒光標記之前,必須先提取、純化樣品核酸。目前普遍采用的熒光標記方法有體外轉錄(NASBA),PCR,逆轉錄(RT)等。
(2)雜交反應 雜交反應是熒光標記的樣品與芯片上的探針進行雜交產生一系列信息的過程。在合適的反應條件下,靶基因與芯片上的探針進行堿基互補形成穩定的雙鏈,未雜交的其他核酸分子隨后被洗去(如果用實時熒光檢測可省去此步)。雜交條件的選擇與研究目的有關,基因的差異性表達檢測需要長的雜交時間、高嚴謹性、高樣品濃度和較低溫度,這有利于增加檢測的特異性和低拷貝基因檢測的靈敏度。在進行突變體檢測和單核苷酸多態性(SNP)分析時,要鑒別出單堿基錯配,需要更高的雜交嚴謹性和更短的時間。此外,雜交反應還必須考慮雜交反應體系中鹽濃度、探針 GC 含量和所帶電荷、探針與芯片之間連接臂的長度、待檢基因的二級結構等因素。
(3)信號檢測和結果分析 當前主要的檢測手段是熒光法和激光共聚焦顯微掃描。在雜交反應完成后,將芯片插入掃描儀中,對片基進行激光共聚焦顯微掃描,樣品核酸上標記的熒光分子受激發出熒光,用帶濾光片鏡頭采集每一點的熒光,經光電倍增管(PMT)或電荷偶合元件(CCD)轉換為電信號,計算機軟件將電信號轉換為數值,并同時將數值的大小用不同顏色在屏幕上直觀地表示出來。
熒光分子對激發光、光電倍增管或電荷偶合元件都具有良好的線性響應,所得的雜交信號值與樣品中靶分子的含量有一定的線性關系。由于芯片上每個探針的序列和位置是已知的,對每個探針的雜交信號值進行比較分析,最后得到樣品核酸中基因結構和數量的信息。