基因組DNA提取與PCR擴增技術

一、基因組DNA提取

實驗目的

基因組DNA的制備是基因分析的前提。 本實驗要求掌握基因組DNA提取的基本方法。實驗原理 DNA在生物體內是與蛋白質形成復合物的形式存在的。核酸與蛋白質之間的結合力包括離子鍵、氫鍵、范德華力等，破壞或降低這些結合力就可把核酸與蛋白分開。 DNA、RNA所含有的嘌呤環和嘧啶環的共軛雙鍵具有吸收紫外光的性質，吸收高峰在260nm處，所以，可用紫外分光光度法測定DNA的濃度。

基因組DNA提取試劑盒：

在高鹽的狀態下，DNA純化樹脂專一性地吸附DNA；而在低鹽或水溶液狀態下，DNA被洗脫下來。

器材與試劑

臺式高速離心機、天平、水浴恒溫箱、移液槍、塑料離心管等 試劑盒（純化樹脂、GN結合液、漂洗液、無水乙醇、離心純化柱）、TE緩沖液操作

1、將全血輕輕混勻，轉移0.5ml全血到1ml純化樹脂中，顛倒混勻5-6次，室溫，3min。其間要顛倒混勻1次，5000r/min離心×3sec；

2、取沉淀，加1mlGN結合液懸浮沉淀，顛倒混勻，5000r/min離心×3sec；

3、取沉淀，加0.5ml漂洗液純化樹脂2次，顛倒混勻，5000r/min離心×3ecs；

4、取沉淀，加0.8ml無水乙醇懸浮沉淀，顛倒混勻；裝入離心純化柱，12000r/min離心×1min，棄乙醇液；

5、空柱再12000r/min離心×1min，進一步棄乙醇液；

6、取離心好的純化柱套入一干凈的1.5ml離心管中，加入100ulTE緩沖液于純化樹脂上（不能粘在管壁上），室溫下放置3min，12000r/min離心×2min。注意事項 一般情況下，純凈的DNAOD260/OD280比值約為1.8，RNA為2.0。若樣品中含蛋白質，則比值下降，必要時需重新抽提。若DNA的比值<1.75，則加入SDS至0.5%； 從核酸中去除蛋白質時，常用到酚：氯仿等體積混合液。氯仿的作用是使蛋白質變性并有助于水相和有機相的分離； DNA用TE溶解，可增加DNA的穩定性，便于長期保存。

二、PCR擴增技術

實驗目的

本實驗以所提出的全血基因組DNA為模板，以線粒體基因上一段核苷酸為引物，擴增出924bp的擴增產物。學習并掌握PCR反應的基本原理與實驗技術。實驗原理 多聚酶鏈反應（PCR）技術的原理類似于DNA的天然復制過程。

可簡述為： 在微量離心管中加入適量緩沖液，加入微量模板DNA，四種脫氧核苷酸（dNTP），和耐熱Taq聚合酶及兩個合成的DNA引物，并有Mg2+存在。 加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。 降低溶液溫度，使合成引物在低溫（56℃）與模板DNA互補退火形成部分雙鏈，這是所謂退火階段。 溶液反應溫度升至中溫（72℃），在Taq酶作用下，以四種dNTP為原料，引物為復制起點，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。

如此反復，在同一反應體系中可重復高溫變性、低溫復性和DNA合成這一循環，使產物DNA重復合成，并且在重復過程中，前一循環的產物DNA可作為后一循環的模板DNA而參與DNA的合成，使產物DNA的量按2n方式擴增。經過25～35個循環，DNA擴增倍數可達106～109。

器材和試劑

器材 PCR擴增儀，旋渦振蕩器，臺式離心機，加樣槍及槍頭等試劑

1、藍色管：TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg＋＋等

2、黃色管：引物1（68kb上游）、引物2（69kb下游）

3、白色管：無菌ddH2O

4、模板DNA：為本次實驗所提出的全血基因組DNA操作 無菌ddH2O21.5ulTaq酶等25ul引物1（68）0.6ul引物2（69）0.9ul模板DNA2ul 混勻后，離心5000r/min×1min，置PCR儀PCR擴增的設定： 設置PCR擴增儀的熱蓋溫度為100℃預變性：94℃5min循環：94℃變性30s 56℃退火30s30個循環72℃延伸30s 末次延伸：72℃5min4℃保存

注意事項

1.由于PCR技術非常敏感，可使一個DNA分子得以擴增，裝有PCR試劑的微量離心管打開之 前，應先在微量離心機上作瞬時離心使液體沉積于管底。

2.zui好在加完所有其它反應成分后才加模板DNA，加模板DNA時不要形成噴霧。

3.若用沒有熱蓋的PCR擴增儀，則需在反應體系中加入液體石蠟等礦物油封閉體系以防止反應 過程中液體的蒸發。