基因構建策略

轉基因
轉基因是線性化的DN**段，通常包含一個啟動子（promoter），一個cDNA，一個內含子和一個多聚腺苷酸信號，常常克隆到一個質粒載體上。當注射到小鼠受精卵的前核內時，它們整合到隨機的位點，通常是包含不同的拷貝數從頭到尾的多聯體。大部分時候，整合發生在單個位點并且存在于整合產生的小鼠的所有細胞中。在小部分情況下，小鼠可能有多個整合位點，或者只在部分細胞中含有轉基因。
當使用cDNA的時候，加入一個人工合成的內含子刺激mRNA運輸出細胞核，因為這個過程是和選擇性剪切過程相偶聯的。人造內含子應該置于cDNA的3’端。
這一主題的一些改變包括：
? BAC轉基因——它們允許插入整個基因，包括所有的內含子和可能的未知啟動子和增強子元件，還有一些允許轉基因即使整合到異染色體中都允許基因表達的“絕緣體”序列。
? 無啟動子轉基因——它們可以發揮基因捕獲或啟動子捕獲的作用，并且通常包含lacz或GFP報告基因的cDNA。
? 加入IRES——內部核糖體進入位點，連同第二個cDNA一起，實現在相同啟動子控制下兩個蛋白的表達。第二個蛋白可以是一個報告分子例如β-半乳糖苷酶或GFP。
? 融合蛋白——通過與一個報告基因或一個附加的親和標記物融合，使蛋白產物的檢測更容易。

 

啟動子
對于任意給定轉基因，最好的啟動子取決于研究的真正目的。
大部分轉基因被設計成導致一個蛋白過量表達。因此強組成型啟動子例如CMV或PGK常用于驅動所有組織中的表達。
組織特異性啟動子可用于限制空間表達型式，而可誘導啟動子被用于控制表達的時間，受發育調控的啟動子也可以用于控制表達時間。
最常用的可誘導啟動子是通過四環素或它的類似物打開或關閉的。這種所謂的Tet-On和Tet-Off載體系統可以從Clontech購買到。這個系統包括兩個分別注射的轉基因，而完整的系統是通過這兩系轉基因小鼠的交配而重建。

同源臂
同源臂和感興趣位點中相同序列的匹配程度將有助于確定同源重組的頻率。同源臂的三個最重要的特征是:
1、 長度——我們推薦的總長度大約為7kb，其中一個臂5-6kb，而另一個臂1-2kb，越長越好，但是常常被克隆載體的能力和需要維持一個可以在轉染入ES細胞前線性化construct的唯一限制性酶切位點所限制。
2、 序列同源性——任何可能的時候，從將要打靶的ES細胞中或將要打靶的ES來源的小鼠系中克隆同源臂。用高保真聚合酶進行長片段PCR是亞克隆同源臂的一種有效方法。
3、 有限的重復序列——我們推薦使用在線程序——RepeatMasker，來搜索同源臂中的重復序列。應該避免大范圍的重復DNA，因為這些可能導致同源重組更低的頻率。

基因打靶的Construct
基因打靶Construct被設計成可以同源重組到研究者選定的特異位點內，通常具有擾亂基因以阻止功能mRNA的轉錄（knock out）或使基因突變（knock-in）的功能。
設計基因打靶construct以產生knock-out或knock in小鼠的方法幾乎是無限的。因此，在這里我們只提供一些普遍的規則，并建議研究者在做任何克隆之前，制備第一個construct時閱讀文獻并向我們或其它更有經驗的研究者咨詢。
最簡單的打靶construct包括2個長片段的基因組DNA（gDNA），叫做同源臂，分別位于一個選擇標記盒的兩側。最常用的選擇標記盒包括新霉素（G418）抗性基因（其它包括嘌呤霉素、潮霉素、硫鳥嘌呤抗性基因）的cDNA和控制元件。
當注射入胚胎干細胞（ES）時，攜帶選擇標記盒的基因組DNA同源臂將會與一條染色體上和它們匹配的序列發生重組。染色體上同源區域之間的gDNA被選擇標記盒和打靶construct兩條同源臂之間的其它序列所取代。            當需要完全knockout的時候，中間的序列常常取代TATA盒、起始密碼和一到多個起始外顯子。
打靶construct也是整合到隨機位點。任何整合事件，隨機或特異，可以賦予細胞藥物抗性。在選擇條件下生長轉染的細胞，挑戰是在頻繁隨機整合的背景中篩選足夠多的克隆找到稀少的同源重組。
我們推薦在所有的打靶construct都使用陽性和陰性兩種選擇標記盒。最常用的陰性選擇標記盒包含胸苷激酶（TK）的基因。胸苷激酶（TK）的基因產物允許生長中的細胞嵌入一個有毒性的核苷酸類似物到它們的DNA，因此反向篩選這些細胞。tk盒克隆到打靶construct同源臂的外面，這樣它在同源重組過程中不會包括進去。它將在隨機整合的過程中整合到基因組，因此有助于反向篩選這些克隆。另一個陰性選擇標記是白喉毒素A的基因，A亞基抑制蛋白合成，但是不能被其它細胞吸收。它比tk優越的地方是它發揮作用不需要在培養基中加入第二種藥物。