實驗概要
本實驗擬通過隨機引物及PCR方法，將DNA探針片段用DIG標記，進一步掌握探針的標記技術。
實驗原理
帶有地高辛標記的dUTP（圖1）通過缺口翻譯、隨機翻譯或PCR等反應而使探針核酸片段帶有地高辛，進一步可與帶有AP、CSP等各種抗地高辛抗體復合物發生免疫反應，使探針上帶有AP等分鐘，進一步能催化化學或發光反應。圖2為各種DIG標記探針及檢測類型匯總；圖3為DIG標記探針的方法；圖5為標記探針應用；圖4為DIG標記探針的檢測方法。
圖1
圖2
圖3
圖4
圖5
實驗步驟
1. 1ug(10ng <DNA探針量<3ug)待標記DNA溶于16ul水中，在沸水浴10分鐘變性，迅速放于冰浴（NaCl或乙醇冰浴）冷卻。
2. 在冰浴上，上述管中加入4ulDIG－HIGH－Prime混合物（含5×反應緩沖液、50％甘油、各1mM的dATP，dCTP，dGTP，0.65mM的dTTP及0.35mM的DIG－dUTP ，1U/ulKlenow酶）。
3. 離心混合，3760分鐘或過夜
4. 加2ul0.2MEDTA(pH8.0)或65℃10min終止反應。
5. 在上述20/22ul反應體系中加入2.5ul4MliCl，75ul(-20℃預冷)乙醇沉淀，70%乙醇洗沉淀，真空干燥，復溶于少量PH8.0TE中，－20℃保存（忌諱反復凍融）。
附 件 (共5個附件,占128KB)
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