噬菌體展示技術研究RNA結合蛋白實驗（三）

4. 免疫印跡檢測外源蛋白的展示情況

pDTSPLAY-B 空載體生成的噬菌體表面不含外源基因，僅有帶有 6 個組氨酸標簽和 Myc 標簽的錨定蛋白（基因 Ⅲ 編碼），此蛋白 SDS-PAGE 中的條帶在 65 kDa 的位置（實際 Mr 為 45 kDa）。pDISPLAY-B 載體中插入外源蛋白編碼基因后，條帶遷移率會明顯變慢。同時電泳兩塊 SDS-PAGE 膠，一塊膠用考馬斯亮藍染色觀察蛋白上樣量，另一塊膠轉膜進行免疫印跡檢測。

(1) 電泳及轉膜

制備常規 8% SDS-PAGE 膠，取 10 μl 噬菌體樣本，加入 10 μl 2X 蛋白電泳上樣緩沖液，100℃ 加熱 5 min 變性。同時制備兩份同樣的樣品上樣電泳。電泳完成后，一塊膠用考馬斯亮藍染色 15 min 至 60 min，脫色后觀察蛋白上樣量。另一塊膠用電轉移的方法將蛋白轉至硝酸纖維素膜，再進行下一步的免疫印跡檢測。

(2) 免疫檢測

常規操作，經過封閉，一抗孵育，二抗孵育，NBT/BCIP 顯色，對結果進行分析。

空載體對照樣本應在 65 kDa 處出現一陽性條帶，含有外源基因的展示噬菌體樣本應該在大于對照樣本的位置出現一陽性條帶（條帶的大小取決于插入基因的長度）。通過免疫印跡檢測不僅可以了解外源蛋白是否得到展示，還可以了解蛋白展示的相對含量。有時可能會檢測到展示蛋白的降解帶（外源蛋白的降解可能發生在噬菌體的包裝過程）。但是，由于免疫印跡并不能顯示噬菌體展示蛋白的功能，如有些蛋白雖然能夠表達，但因為折疊的錯誤可能會導致不再具備 RNA 結合的功能；因此還需要進一步對所展示的蛋白的 RNA 結合活性進行檢測。

5. 噬菌體展示蛋白的 RNA 結合活性進行檢測

(1) 靶 RNA 的制備

① 將靶 RNA 序列通過 HindⅢ 和 PstⅠ 兩個酶切位點插入 pGEM 衍生載體，構建重組克隆 [ 重組克隆的構建可以采用人工合成靶 RNA 序列所對應的 DNA 序列及互補 DNA 序列（各約 70 個核苷酸），將合成的雙鏈進行體外退火后再克隆到載體 ]。轉錄前以 AvaⅠ 酶切重組質粒，線性化后的質粒需經過純化才能作為轉錄模板。按照 Mega ( short ) scrip kits 試劑盒所描述的方法轉錄獲得靶 RNA ( 通常采用 8 μg 模板 DNA 每 20 μl 反應體系）。

② 轉錄獲得的 RNA 經酚：氯仿抽提，乙醇沉淀進行純化。

③ 配制 5%~8% 的變性丙烯酰胺膠，275 V 室溫預電泳 30 min。

④ 用 4 μl TE 溶解沉淀獲得的 RNA，加入 4 μl 甲酰胺和 2 μl 上樣緩沖液，85°C 加熱 5 min，上樣，250 V 電泳 1~2 h。

⑤ 凝膠用含 10 μg/ml 溴化乙錠的 1X TBE 振搖染色 15 min；1X TBE 振搖脫色 2 次，每次 10 min。

⑥ 切膠獲取目的 RNA 帶，將切下的含靶 RNA 的膠放入底部扎眼的 0.5 ml 管中，再放入 1.5 ml 離心管中，離心 2 min 破碎膠。

⑦ 在盛膠的管內加入等體積 TE、0.2% SDS，混合 1 h 或 4℃ 過夜。將混懸液加入無菌的 Sephadex G-50 柱，150 g 離心 2 min，洗脫液收集至一干凈的離心管內。

⑧ 再在 Sephadex G-50 柱內加入 50 μl TE/SDS，再次 150 g 離心 2 min，洗脫液收集入同一個離心管內。

⑨ 酚：氯仿抽提一次，氯仿再抽提一次。將上清轉移至新的離心管中，加入 1/10 體積加 3 mol/L 乙酸鈉、2.5 倍體積乙醇沉淀，70% 乙醇洗鹽，最后溶解于 50 μl TE 中。

⑩ 1：100 稀釋 RNA 溶液，檢測 A260，計算 RNA 濃度（= 40 μg/ml X A260）。同時，取 40 pmol RNA 電泳，檢測 RNA 的回收率和是否降解。

(2) RNA 與鏈親和素順磁珠結合

鏈親和素順磁珠的結合能力為每 10 μl 鏈親和素順磁珠可以結合 2~5 pmol 退火的 RNA，這相當于 ≥1012 個結合位點（按每個 RNA 含一個結合位點推算），因此 10 μl 鏈親和素順磁珠進行結合反應后可以多次使用。

第一次進行 RNA 與鏈親和素順磁珠結合的實驗時，最好檢測一下 RNA 與 DNA 寡核苷酸的退火效率。可以用恒定量的放射性標記的 RNA 同不同量的 DNA 寡核苷酸進行反應，用非變性膠電泳檢測。與 DNA 寡核苷酸退火的 RNA 電泳遷移率明顯減慢。放射性標記的退火的 RNA 同樣可用于 RNA 與鏈親和素順磁珠結合程度的檢測。

① 取 5 pmol RNA（1 μl），5 pmol 寡核苷酸（1.5 μl）混勻，85°C 加熱 3 min。

② 樣品放置 3 min 冷至室溫。

③ 加入 1 倍體積 2X TENT 結合緩沖液。

④ 取 10 μl 鏈親和素順磁珠，用 1 倍體積 1 mol/L NaOH、0.1 mol/L NaCl 洗 2 次；再用 1 倍體積 0.1 mol/L NaCl 洗 2 次。

⑤ 1 倍體積 1X TENT 結合緩沖液重懸磁珠。

⑥ 去除緩沖液，加入 DNA/RNA 雙鏈體（5 pmol ) 和 5 μl tRNA（40 μg），混合后置于室溫 30 min。

⑦ 用 1X TENT 緩沖液洗 3 次，去除末結合的 RNA。

⑧ 用 10 μl 1X TENT 緩沖液重懸。

(3) 展示噬菌體與鏈親和素順磁珠結合

通過滴度檢測可以知道噬菌體顆粒的數量，然后將噬菌體樣本與含有過量靶 RNA 的磁珠混合，通過洗脫非特異結合得到特異性結合的噬菌體的數量。結合的噬菌體數目與最初的噬菌體數目的比值就是結合率。在實驗體系中加入 lacZ 標記的噬菌體。在含有 X-Gal 的培養板上，lacZ 標記的噬菌體轉染的宿主菌形成藍色克隆。計數篩選前后的藍色克隆數目就可以獲得非特異本底結合的數據，此外，也可以通過設置未結合 RNA 或結合了無關 RNA 的磁珠實驗組作為本底結合的對照。

① 噬菌體結合反應混合物：在 1X TENT 結合緩沖液中加入約 1X1010 集落生成單位制備好的 “展示” 噬菌體、40 μg tRNA，40 U RNasin，總體積為 30 μl。同時還可以在反應混合物中加入 5 倍過量的 lacZ 標記的噬菌體。可以多配一部分反應混合物，多出的部分可用于檢測最初反應混合物中的噬菌體的數量。

② 去除結合有 RNA 的順磁珠中的緩沖液，加入噬菌體結合反應混合物，室溫輕柔振搖反應 30 min。

③ 用 1X TENT 緩沖液快速洗磁珠 2 次，再用 100 μl 1X TENT 緩沖液重懸磁珠。

④ 將這 100 μl 樣品進行 6 次 1：100 稀釋（5 μl→495 μl），分別取 100 μl 10-8，10-10 和 10-12 稀釋液，各加入 100 μl 宿主菌，37℃ 培養 30 min，涂布 LB 板（含 100 μg/ml 青芐青霉素，2% 葡萄糖和 40 μg/ml X-Gal）。同時設置未與順磁珠反應的噬菌體結合反應混合物 [ 來源于步驟 (1) ] 不同稀釋倍數的對照。

⑤ 將培養板在 37℃ 孵育過夜，第二天計克隆數。在進行結合篩選后，藍色克隆與白色克隆的比例應明顯降低，這種比例通過選擇性結合后會顯著性降低，一般情況下，2%~5% 的展示噬菌體可以同 RNA-磁珠結合，本底結合應低于 0.005%。因此，通過一輪的選擇性結合后可以使目的噬菌體的純度提高 3~4 個數量級。

6. RNA 結合蛋白的體外篩選

噬菌體展示技術適于研究 RNA-BP 中的 RNA 結合結構域與 RNA 間的相互作用。可以對通過蛋白質中的 RNA 結合結構域進行突變（隨機突變或選擇性突變某些可能具有活性功能意義的氨基酸），來深入研究蛋白質與 RNA 相互作用的分子機制。在構建噬菌體展示庫時，有 2 種經常采用的方法。一種是將 RNA-BP 編碼基因的一部分用含有一個或多個隨機突變區的合成寡核苷酸取代的方法，另一種方法是用部分隨機寡核苷酸作為引物進行 PCR 擴增，再將 PCR 產物整合到目的基因的方法，突變方法的選擇影響著研究所涉及的氨基酸的廣泛性。由于細菌轉化本的限制（最好控制在 1010），復雜性大于1010 的庫無法在一次實驗中全面篩選。這并不是說不能使用大于 1010 的庫，只是意味著對于復雜的庫進行研究分析時，一次篩選過程無法對所有的克隆均進行分析。對于一個完全隨機的突變庫，對應每一個氨基酸位點都有 21 種可能性（20 種氨基酸加上終止密碼），如果希望所構建的庫能夠代表所有的突變可能，那么，最多只能對 7 個氨基酸進行隨機突變。因此要根據實際研究的問題來確定構建突變體庫的方法和策略。

(1) 噬菌體展示庫的制備

① 用構建好的噬菌體展示庫轉化宿主菌，按每 25 cm X 25 cm 板不超過 100000 個克隆的密度涂布 LB 板（含 100 μg/ml 氨芐青霉素和 2% 葡萄糖）。如果庫容量過大，就需要在含 100 μg/ml 氨芐青霉素和 200 μg/ml 的甲氧苯青霉素培養液中液相培養數小時。液相培養的不足之處就是一些具有生長優勢的克隆會得到較大比例的擴增。

② 用 2X YT 培養液刮取培養板上長出的克隆，加入 16% 甘油，-80℃ 保存。液相培養的細菌經過離心后用少量 2X YT 重懸，加入 16% 甘油，-80℃ 保存。這是第一代庫保存液，稱 R-0 ( Round-0）。可以通過對 R-0 中數個單克隆樣本或多克隆樣本進行測序來 檢定突變庫的質量。

③ 取適量 R-0 噬菌體庫甘油保存液，在 30 ml 2X YT（含 100 μg/ml 氨芐青霉素和 2% 葡萄糖）培養液中培養至 OD600 達 0.5，用輔助噬菌體進行感染，方法同前面3 “制備展示噬菌體”。

(2) 體外檢測噬菌體展示庫與靶 RNA 的結合

篩選方法的選擇取決于噬菌體展示庫的復雜性。如果是對一個復雜性很高，克隆很多，并且具有不同的親和力的庫進行篩選，最好采用前面介紹的預先用過量的 RNA 與磁珠結合的篩選方法。如果所研究的噬菌體庫展示蛋白與 RNA 的親和力彼此相近，則可以采用較為嚴謹的篩選方法，降低靶 RNA 的濃度；噬菌體先與 DNA-RNA 雙鏈體共孵育，再與磁珠結合。除了方法的選擇外，還應注意在實驗過程中設置對照以方便結果分析。每天培養新鮮的宿主菌以方便滴度測定。

① 第一天按 1：500 稀釋過夜培養宿主菌至 LB 培養液，37°C 250 r/min 振搖培養 6 h，用于滴度檢測。在結合緩沖液中加入噬菌體展示庫和 RNA-DNA 雙鏈體（制備方法同前，先將 RNA 與 DNA 退火，再將其稀釋至合適的濃度，如 RNA 濃度接近或低于 Kd），結合緩沖液中應具備合適的鹽濃度、2 μg/μl tRNA 和 2 U/μl RNasin。

② 結合反應達平衡后，加入磁珠（預洗方法同前），室溫緩慢旋轉反應 30 min。

③ 用 1 ml 結合緩沖液快速洗磁珠 2 次，再用 100 μl 結合緩沖液重懸磁珠。獲得 R-1（round-1）噬菌體，4°C 保存。

④ 連續稀釋 R-1 噬菌體樣品，分別取 100 μl 10-4 稀釋液、10-6 稀釋液和 10-8 稀釋液，各加入  100 μl 宿主菌，37℃ 培養 30 min，涂板進行滴度檢測。同時測定未經結合篩選的噬菌體的滴度以進行比較。

⑤ 第二天，按 1：500 稀釋過夜培養宿主菌至 LB 培養液，37°C 250 r/min 振搖培養 6 h，用于滴度檢測。

⑥ 計數用于滴度測定的培養板上的克隆數，計算末經結合篩選的噬菌體和 R-1 噬菌體的滴度、及篩選過程中噬菌體結合的比例。

⑦ 用適量的 R-1 噬菌體感染步驟 (5) 中稀釋擴增的宿主菌，使宿主菌過量以保證噬菌體的感染率（1：500 稀釋后培養 6 h 約為 104 細胞/ml），37℃ 培養 30 min。

⑧ 將感染的細胞涂布 LB 板（含 100 μg/ml 氨芐青霉素和 2% 葡萄糖），37°C 過夜培養。

⑨ 第 5 天，用 2X YT 培養液收集培養板上長出的克隆，加入 15% 甘油，制備出 R-1 噬菌體庫，-80℃ 保存。此噬菌體展示庫又可以用輔助噬菌體進行感染，進行下一輪的蛋白展示、RNA 結合、感染宿主菌、篩選結果分析等工作。

7. 結果分析

每次通過與 RNA 的結合對噬菌體進行篩選之后再對噬菌體滴度進行檢測不僅有助于了解每次實驗操作中所篩選的噬菌體的數量，還可以了解到篩選的進行程度。經過篩選，一定比例的噬菌體被磁珠結合而富集；當與磁珠結合的噬菌體比例達到平臺時，表明 噬菌體展示的蛋白結構域與 RNA 的親和力相近的克隆得到了篩選。這時就可以停止篩選或者是提高篩選的嚴謹性。要達到何種程度的篩選目的決定著篩選次數：如果是為了篩選得到與特異序列具有強結合力的突變蛋白，最好的結果就是通過多輪篩選獲得單一的高結合力的克隆；如果只是對一段蛋白中一些氨基酸與靶 RNA 結合中的相對重要性進行研究，就需要對一些在篩選過程中得到富集的克隆進行序列分析以尋找規律，而獲得單一的高結合力的克隆在這種分析中是沒有意義的。

起始庫的大小對于篩選次數也有很重要的影響。被篩選的庫越復雜，所需要的篩選次數就越多。由于需要的篩選次數無法預測，所以只能以篩選過程中噬菌體的結合量作為判斷標準。一旦結合水平不再升高，就可以停止篩選，通過測序等手段對篩選結果進行 分析。通過篩選可能獲得與 RNA 結合的一些保守序列等結果，當然這些結果還需要其他實驗的證實。