吲哚乙酸氧化酶活性的測定

發布時間：2019-11-25 11:16 原文鏈接：吲哚乙酸氧化酶活性的測定

原理

吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破壞失去活性。植物體內吲哚乙酸氧化酶活力的大小，對調節體內吲哚乙酸的水平，起著重要的作用，而影響植物的生長。酶活力的大小可以其破壞吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法測定。

儀器藥品

　　恒溫水浴鍋　　　　　　　天平

　　研缽　　　　　　　　　試管

　　移液管　　　　　　　　燒杯

20mmol/L磷酸緩沖液，pH6.0。

1mmol/L2，4—二氯酚：稱取二氯酚16.3mg用蒸餾水配制成100ml。

1mmol/L氯化錳：稱取MnCl₂ ·4H₂ O 19.8mg用蒸餾水配制成100ml。

1mmol/L吲哚乙酸：稱取IAA 17.5mg用少量乙醇溶解，然后將其倒于盛有約90ml蒸餾水的容量瓶中(100ml)，稀釋至刻度。

吲哚乙酸試劑A或B（任備其中之一）：

試劑A：15ml 0.5mol/L FeCl3,300ml濃硫酸（比重為1.84），500ml蒸餾水，使用前混合之即成，避光保存。用時1ml樣品中加入試劑4ml。

試劑B：10ml 0.5mol/L FeCl3,500ml 35%過氯酸，使用前混合之即成，避光保存。用時于樣品中加入試劑。試劑B較試劑A靈敏。

操作步驟

1．將大豆或綠豆種子于30℃溫箱中萌發3梍4天，選取生長一致的幼苗，除去子葉，留下胚軸作材料。

2．取20株胚軸，稱得重量，置研缽中，加入預冷的磷酸緩沖液5ml，石英砂少許，置冰浴中研磨成勻漿。再按100mg鮮重材料加1ml提取液的比例，用磷酸緩沖液稀釋之。離心（4000r/min）20分鐘，所得上清液即為粗酶液。

3．取試管2支，于一試管中加入氯化錳1ml，二氯酚1ml，IAA2ml，酶液1ml，磷酸緩沖液5ml，混合均勻。另一試管中除酶液用磷酸緩沖液代替外，其余成分相同。一起置于30℃恒溫水浴中，保溫30分鐘。

4．吸取反應混合液2ml，加入吲哚乙酸試劑B4ml，搖勻，置于30℃的黑暗處保溫30分鐘，使顯色。

5．將顯色后呈現紅色的反應液于分光光度計中測定吸光度，測定時用波長530nm。

6．根據讀數從標準曲線上查出相應的吲哚乙酸殘留量（或從直線方程式計算反應液中IAA的殘留量）。

7．從開始時加入的吲哚乙酸量減去酶作用后殘留的吲哚乙酸量，即得被酶所分解破壞的吲哚乙酸量。以每ml酶液在1小時內分解破壞吲哚乙酸量(μg)表示酶活力的大小。

8．配制濃度從0梍25μg/ml的IAA溶液，分別測得吸光度A，然后繪制標準曲線，或計算直線回歸方程。