反相高效液相色譜

蛋白質標樣

乙睛（HPLC級） 去離子水（HPLC級） 三氟乙酸（TFA)

HPLC 色譜系統 反相柱

1.進行空白或對照層析譜分析（即在步驟①中不加樣）。一般這是進行一天層析工作的開始。下面是推薦使用的用于 RP-HPLC 系統評估的標準色譜條件。

（1）線性梯度：從 0~100% 的溶劑 B，溶劑 A 是 0.1% 的 TFA 水溶液 (體積分數），溶劑 B 是含 0.09%TFA 的 60% 乙腈水溶液；

（2）梯度率：1%B/min(即 60 min 內溶劑 B 從 O 到 100%);

（3）流速：lml/min(4.6 mm 內徑層析柱）；0.lml/min(2.1 mm 內徑層析柱）

（4）溫度：40~45°C。

2.標樣蛋白（對照組）色譜分析。在步驟①中，對于 4.6 mm 層析柱來說，注入 1OOul 標樣蛋白（0.lmg/ml)(即每標樣蛋白為 10ug，流速為 lml/min 時 1ug=1OOmAU); 對于 2.1 mm 層析柱，加入 l0W 濃度為 0.lmg/ml 的標樣蛋白，即每種標樣蛋白 1ug(在流速為 0.lml/min 時，1ug=100mAU)。

3.消化肽的混合物色譜分析，用與步驟②中相同的條件。

4.樣品的收集。在有蓋的聚丙烯微量離心管中收集洗脫下來的肽峰，蓋緊蓋子，于-20°C 保存，以便進一步研究。如果是人工收集樣品，檢測器的流動池與出口管間的死體積必須精確計算。

5.對于要長期保存的層析柱，先將層析柱沖洗干凈，然后儲存于親水性有機溶劑中（如 50% 丙酮水溶液）。對于過夜保存的層析柱，可以用溶劑 B 以非常低的流速沖洗層析柱（如流速為 50ul/min)。