| 實驗步驟 |
第一階段 誘餌-LexA 融合蛋白的鑒定
材料
緩沖液和溶液
將貯存液稀釋到適當濃度。
2XSDS 凝膠上樣緩沖液
100 mmol/L Tris-Cl(pH6.8)
200 mmol/L 二硫蘇糖醇
4%SDS(電泳級）
0.2% 溴酚藍
20% 甘油
不含二硫蘇糖醇的 SDS 凝膠上樣緩沖液可在室溫存放。緩沖液用前在 1mol/L 貯存液中加入二硫蘇糖醇。
凝膠
SDS 聚丙烯酰胺凝膠
制備蛋白質分離用的 SDS 聚丙烯酰胺凝膠，請見附錄 18。
核酸和寡核苷酸
編碼目標蛋白（誘餌）的靶 DNA
抗體
抗 LexA 的單克隆抗體（CLONTECH) 或抗 LexA 的多克隆抗體（Invitrogen) 或抗靶蛋白質融合域的特異性抗體（如果有的話）。
培養基
酵母培養基的成分請見附錄 2。
CM 選擇性培養基
用表 18-3 估計褥要培養基的量，用表 18-4 制備必需的選擇性培養基。
商品銷售的無氧基酸的酵母氮源（YNB) 有含硫酸胺和不含硫酸胺兩種。表 18-4 假定 YNB 含硫酸胺。如杲盛酵母氮源的瓶子上指示加 1.7 g/L 來配置培養基, 它就不含有硫酸胺，應當在每升培養基中加 5 g 硫酸胺。
酵母選擇性 X-gal 培養基
1. 按表 18-4, 以 900 ml 水制備基礎培養基。將基本培養基高壓滅菌并冷卻到 55°C。
2. 在另一個瓶子中，以 100 ml 蒸餾水溶解 7 g 磷酸氫二鈉和 3 g 磷酸二氫鈉，然后髙壓菌。
3. 將兩種高壓滅菌的溶液混合在一起，并加入 0.8 ml 濃度為 100 mg/ml 的 X-gal(在 N,N-二甲基甲酰胺中), 鋪平板。
YPD 培養基
20 g 蛋白胨
10 g 酵母提取物
20 g 葡萄糖
20 g 瓊脂（如果用于平板）
加 1L 蒸餾水并高壓 20 min。鋪板前將高壓滅菌的培養基冷卻到 55C。
專用設備
干冰/乙醇浴鍋
請見步驟 13。
平頭牙簽，滅菌的
滅菌時，將標準牙簽轉移到 250 ml 燒杯中，用鋁鉑紙包蓋燒杯，在標準干燥條件下高壓滅菌。
預設到 100°C 的加熱包或熱循環儀，或沸水浴。
附加試劑
本方案第 1 步需要亞克隆試劑，列在第 1 章方案 17。
本方案第 2 步需要酵母轉化試劑，列在 Spector 等的文獻中（1998, 第 21 章）。
本方案第 17 步需要免疫印跡試劑，列在附錄 8。
載體和酵母菌
選擇和擴增載體用的釀酒酵母菌（請見表 18-6)
帶 LexA(請見表 18-1) 和活化域融合序列（請見表 18-2) 的載體，以及 LacZ 報道子質粒（請見表 18-5)。
方法
誘餌-LexA 融合蛋白的構建
1.將編碼誘餌蛋白的靶 DNA 克隆到 LexA 融合載體（如，pMW101 或 pMW103) 的多聚接頭處，以合成一種框架內的 LexA 融合基因。確定誘餌序列的羧基端存在翻譯終止序列。形成的質粒作為 pBait。
2. 采用下列 LexA 融合基因和報道質粒的組合，建立一系列 EGY48 lexAop-LEU2 選擇的轉化酵母菌：
a.pBait+pMW112(活化測定）
b.pSH17-4+pMW112(活化的陽性對照）
c.pRFHMl+PMW112(活化的陰性對照）
d.pBait+pJK101(抑制/DNA 結合測定）
e.pRFHMl+pJK101(抑制的陽性對照）
f.pJK101單獨（抑制的陰性對照）
每種質粒功能的描述，請見表 18-1 和 18-2。
3. 將每種轉化混合物鋪在適宜的選擇性缺陷板上:CM(Glu)-Ura-His(針對質粒組合 a~e) 或 CM(Glu)-Ura(針對質粒組合 f)。將培養板在 37°C 培養 2~3d 以選擇含有質粒的轉化酵母克隆。
如果克隆在 3~4d 內沒有出現，或只有很少量的克隆（<20), 則應重新轉化。
4. 制備轉化子的母板，從中可按步驟 5~9 描述的那樣，對具有 lacZ 和 LEU2 報道子活化表型的特異性克隆進行分析。
活化和抑制活性的鑒定：X-gal 和 Leu2 表型的分析
步驟
5~9 用于測試誘餌-LexA 融合蛋白質的轉錄激活性，并證實誘餌的融合物不影響 DNA 結合活性（抑制分析的圖示請見圖 18-9)。對步驟 2
中轉化的每種質粒組合，挑選幾種單個克隆做分析。這對于某些誘餌的構建非常重要，因為蛋白質表達水平在不同克隆中會有變化，正如活化兩種報道子轉錄激活的表觀能力有變化一祥。在第一階段結束處的替代方案中，給出了一種替代步驟
5~8 的、通過氯仿交疊分析來測試活化的方法。
5. 從 a~f 的每個轉化（取自步驟 2) 中，用無菌的平頭牙簽挑選約 8
個克隆。用干凈的牙簽觸及克隆以挑取細胞，使它們在新鮮的 CM(Glu)-Ura-His 或 CM(Glu)-Ura 板上的小格內成為 lcm
長的線。通常可在一個板上形成多達 60~80 條線。將平板在 30°C 孵育過夜。
6.第二天，從兩個母板中再劃線到下列每個板上：
轉化 a~f: 劃線到 CM(Glu,X-gal)-Ura 和 CM(Gal，X-gal)-Ura 上
轉化 a~c: 劃線到 CM(Glu)-Ura-His-Leu 和 CM(Gal)-Ura-His-Leu 上
7. 在 30°C 將平板孵育到 4d。
8. 對抑制和激活性進行分析；
a. 對于抑制活性，在劃線接菌約 12~24 h 時觀察 X-gal 表型。
b. 對于激活性，在劃線接菌 18 h 到 72 h 之間觀察 X-gal 表型。
c. 在 48 h 到 96 h 之間觀察 Leu2 表型。在表 18-7 中給出了具有良好表現的誘餌所應得的預期結果，并總結如下。
（1）最好在接種到 CM(Gal,X-gal)-Ural2~24 h, 應當能看出 d+e 轉化比 f 的顏色淺。
在接種到 CM(Glu，X-gal)-Ura 48 h,b 轉化應當是亮藍色,c 應當是白色，而 a 應當是白或很淡的藍色。
（2）在接種后 48 h, 在 CM(Glu)-Ura-His-Leu 或 CM(Gal)-Ura-His-Leu 上，b 轉化應當同在 CM(Glu)-Ura-His 母板上一樣很好生長，而 a 和 c 應當不生長。
（3）最理想的是,a 轉化在接種后 96 h 內仍沒有明顯的生長。
9.基于抑制和激活分析的結果，選擇適當的候選克隆。
檢測誘餌蛋白質表達
10. 在母板上，標記要分析蛋白質表達的克隆。用已證實適宜表達誘餌的克隆作為基礎菌培養，供文庫轉化用（在第二階段中）。
11. 對每個新的誘餌構建，至少分析兩個初級轉化子。還要包括兩個作為蛋白質表達陽性對照的轉化子（如 pRFHMI)。
a. 用無菌牙簽從 CM(Glu)-Ura-His 母板上挑取克隆，于 CM(Glu)-Ura His 液體培養基中生長。如果帶手套，牙簽可落入培養管并留在那里，不用擔心污染。
b. 在滾筒或其他搖動儀器上 30°C 培養過夜。
c. 早晨，將達飽和的培養液稀釋到含 3~5 ml CM(Glu)-Ura-His 的新培養管中，使初始密度 OD600 約為 0.15。30°C 培養 4~6 h, 直到光密度大約增大兩倍（OD600 約 0.45~0.7)。
12. 轉移 1.5 ml 培養液到一個微量離心管中，在離心機上以最大速度離心細胞 3~5 min。可見沉淀的體積應為 2~5ul。小心傾去或吸除上清。
一些（盡管不是所有）LexA 融合蛋白隨生長靜止相啟動，表現出可檢測的蛋白質水平急劇增加。因而，不需要為了期望増加分析蛋白的產率而使培養進行到飽和。
如果預期要進行一輪以上的分析，在此階段冰凍雙份樣品可能會有好處。
13. 加入 50ul 的 2XSDS 凝膠加樣緩沖液到離心管中，快速震蕩離心管以懸浮沉淀。立即將離心管放在干冰上或干冰/乙醇浴中。
樣品或即刻用于分析，或在-70°C 冰凍，這樣至少可以保持穩定 4~6 個月。
14. 將樣品從干冰或-70°C 直接轉到 100°C, 并煮沸 5 min。
設定到 100°C 的 PCR 僅最方便，當然也可用水浴或加熱。
15. 將樣品在冰上冷卻并在離心機上以最大速度離心 5~30s 以沉淀大的細胞碎片。加 20~50ul 樣品到 SDS 聚丙烯酰胺凝膠的每個泳道中。
16. 電泳并分析產物以確定預期大小的誘餌蛋白是否以合理的水平表達。
17. 為防止可能出現的問題，通過免疫印跡來分析含 LexA 融合的誘餌的酵母裂解液（請見這一步的注解)。
免疫印跡可按附錄 8 描述的進行。LexA 融含物可用計對融合域的抗體來檢如果沒有，也可用抗 LexA 的抗體替代。
確定一種誘餌蛋白的重要一步是直接分析誘餌是否可被檢測到，以及誘餌大小是否正確。在多數情況下，上述兩項都是正確的。然而，一些蛋白質（特別是融合域在約
60~80kDa
或更大時）或者合成水平很低，或者在翻譯后被蛋白酶剪斷。這兩種結果都可能導致在文庫篩選中出現問題。低水平表達以及在轉錄活化分析中無表觀活性的蛋白質,
可在亮氨酸選擇下上調到較高水平，然后突然顯示轉錄活化的高背景。在蛋白質由于發生蛋白質水解而剪斷時, 對于僅與較大誘餌的氨基端融合的 LexA
來說，篩選仍然可以進行。
第二階段 篩選一個相互作用子
材料
緩沖液和溶液
將貯存液稀釋至適當的濃度
二甲基亞砜（DMSO)
乙醇
可選擇，請參見步驟 9。
凍存轉化體用的無菌甘油溶液
65% 無菌甘油
0.1mol/LMgS04
25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
TE(pH7.5)（無菌）
TE(pH7.5)，含 0.1mol/L 乙酸鋰
TE(pH7.5), 含 40%PEG4000 和 0.1mol/L 乙酸鋰（無菌）
核酸和寡聚核苷酸
載體 DNA
剪切處理的鮭精
DNA 為典型的常用載體。髙質量的 DNA 是非常重要的。使用低質量的制品可能降低 1~2 個數量級的轉化頻率。生產髙質量鮭精 DNA
的簡便方法請參見 Schiestl 和 Gietz(1998) 的方法和第 6 章方案 10, 也可選擇許多公司出售的這種商品。
相互作用篩選文庫
培養基
CM 選擇培養基
利用表 18-3 估計所需培養基的量，根據表 18-8 制備所需的選擇培養
無氨基酸的酵母 (YNB) 分含或不含硫酸銨兩類，均有銷售。表 18-8 中假定 YNB 中含有硫酸銨。如果酵母氮源包裝瓶上說明制備培養基需加 1.7 g/L 酵母氮源，那么它躭不含有硫酸銨，配制時每升培養基中應加入 5 g 硫酸銨。
酵母選擇 X-gal 培養基
1. 按照表 18-8 在 900 ml 水中制備基礎培養基，高壓滅菌后冷卻至 55°C。
2. 在另一個瓶于中，將 7 g 磷酸氫二鈉和 3 g 磷酸二氫鈉溶于 100 ml 蒸餾水中，高壓滅菌。
3. 將兩種髙壓滅菌溶液混合在一起，加入 0.8 ml 濃度為 100 mg/ml 的 X-gal(格于 N,N-二甲基甲酰胺), 鋪制平板。
離心機和轉子
Sorvall GSA 轉子或等同物
Sorall RT6000 離心機和 H1000B 轉子或等同物
專用設備
選擇培養基用培養極（24 cmX24 cm)(見表 18-3)
這些培養板非常昂貴，但是可以重復使用很多次（見步驟 9)。
Falcon 管（50 ml，無菌）
玻璃珠（直徑 0.45 mm, 無菌；Sigma)
可選，請見步驟 9。
加熱塊，預設至 42°C
微量滴定板（96 孔）
可進，請參見步驟 21。
多道移液器或接種多支管/蛙形器（例如 Dankar Scientific)
可選，請參見步驟 21。
用于多菌落轉移的蛙形器可以購買或自己制造也很容易；蛙形器的所有輻條都有一個平坦的表面且輻條末端保持水平是很重要的。蛙形器可以通過高壓或乙醇灼燒來滅菌。
載體和細菌菌株或酵母菌株
攜帶表達誘餌蛋白質和 lexAop/lacZ 報道子的載體的釀酒酵母候選菌株（來自第—階段）。
方法
轉化文庫
1. 挑選一個在第一階段的原始對照試驗中狀態最好的表達誘餌蛋白和 lexAop-lacZ 報道子的酵母菌落，接種于 20 ml CM(Glu)-Ura-His 液體培養基中，30°C 搖動過夜培養。
重要：應該在用文庫重新轉化之前 7~10d 內，將誘餌蛋白和 lexAop-lacZ 報道子質粒轉化到酵母中。在整個試驗過程中始終保持無菌條件非常重要。
2. 稀釋 20 ml 的過夜培養物于 300 ml 的 CM(Glu)-Ura-His 液體培養基中，以使稀釋后培養液的 OD600 約為 0.10~0.15。在旋轉搖床上 30°C 搖動培養，直到該培養物增殖 1~5 倍，OD600 達到 0.50 左右。
3.
把培養物轉移至 1 個 250 ml 的無菌離心瓶中，室溫下 1000~1500 g(使用 Sorvall GSA 轉子
2500~3000r/min) 離心 5 min。移去上清，加入 30 ml 無菌水，在工作臺上輕輕拍打離心瓶重新懸浮沉淀，轉移混合物至 1 個
50 ml 的無菌 Falcon 管中。
4.1000~1500 g(使用 Sorvall GSA 轉子 2500~3000r/min) 離心酵母細胞 5 min。倒掉水，重新懸浮酵母細胞于 1.5 ml 含 0.1mol/L 乙酸鋰的 TE(pH7.5) 中。
5. 在 30 個 1.5 ml 的無菌小離心管中分別加入 1ug 的文庫 DNA 和 50ug 剛剛變性的載體 DNA。馬上在每個小離心管中加入 50ul 的酵母懸浮液（來自步驟 4)。
—個成功的轉化試驗，每微克文庫 DNA 應該產生約 105 個轉化子。使用小體積的 DNA(最好毎個轉化管中少于 10ul) 通常可以提高轉化效率。
平行地進行多份小量的酵母轉化有利于喊少污染的概率，而且這種方法與在較少試管中采用較大體積相比，經常可以得到顯著更髙的轉化效率。每份感受態酵母細胞懸泮液中不要加入過多的轉化文庫 DNA, 否則每個感受態細胞可能吸收多個文庫質粒，使后面的分析復雜化。
6. 在每管細胞懸浮液中加入 300ul 含 40%PEG4000 和 0.1 ml/L 乙酸鋰的無菌 TE(PH7.5), 輕輕翻轉試管若干次使混合（不要振蕩)，30°C 培養 30~60 min。
7. 每個試管中加入 40ul DMSO, 翻轉混勻懸浮液，在 42°C 的加熱塊上加熱 10min。
8. 按照下述步驟將轉化混合物鋪平板：
其中的 28 管只用于產生轉化子
a 把每管中的混合物加到 24 cmX24 cm 的 CM(Glu)-Ura-His-Trp 選擇平板上。
b. 將細胞涂勻，并將平板置于 30°C 孵育直到菌落出現。
每個
24 cmX24 cm 平板需要 250~300 ml 的培養基，應該在倒制平板后室溫干燥 1~2d
再使用。為了減少污染的機會，倒制平板后需用火烘烤平板表面。一些研究人員采取了另外的處理方法：打開平板，翻轉蓋子放置在標準組織培養超凈臺內，紫外線照射約
10 min。
剩余 2 管用來評價轉化效率
a. 從每個管中取 350ul 混合物加卻 24 cmX24 cm 的 CM(Glu)-Ura-His-Trp 平扳上。
b. 鋪平細胞，30°C 培養平板直到菌落出現。
c. 吸取每管中剩余的 40ul 混合物用無菌的 TE(pH7.5) 或水做一系列的 1:10 稀釋（至少 3 次)。
d. 每份稀釋液吸取 100ul 鋪在 100 mmCM(Glu)-Ura-His-Trp 平板上，30°C 培養平板直到菌落出現。
分析稀釋度能夠大致估計所得轉化子的數目。100 mm 指示平扳上預測增加的轉化子菌落數目偶爾與 24 cmX24 cm 平板上的數目有顯著的不同，尤其是不同批次的平扳之間。一個成功的轉化實驗中每個大平板上應該產生 20000~40000 個菌落。
初級轉化子的收獲和富集
步驟 9~14 提供代表全套初級轉化子的凍存物，可用于后面的篩選。在這個實驗中，從初級轉化子（約 106 個細胞）制備同質的細胞懸液，每一份都可以用來在選擇培養基上進行平板篩選。這項技術代表了更加常規的轉移酵母的方法（例如：復制平板培養），它轉移了如此大量的細胞，以至于在選擇培養基上可以觀察到某種程度上導致虛假背景的細胞生長。如果在平板上觀察到可見的霉菌斑或其他的污染，那么在收獲文庫轉化子之前，用無菌刀片小心地切去污染物及其周圍部分。
在步驟
9
中，第一種方法（揺動法）操作起來很快，可以在同一天進行文庫的誘導和選擇培養基上的篩選，它也縮短了平板打開的時間，從而避免源于空氣傳播的霉菌和細菌的污染。大約三分之一的酵母細胞懸浮液將留在平板上；然而正常情況下所使用的量不超過收集懸液的
2%，所以保證酵母菌落以大致相等的概率從平板上洗脫是很重要的。步驟 9
中的第二種方法（刮擦法）節省試劑，而且可以方便地在已經切掉霉菌和污染物的平板上使用。
9. 使用下列方法之一收獲文庫。
1) 通過搖動法收獲文庫
a. 分別在 5 個含有轉化子的 24 cmX24 cm 平板上倒入 10 ml 無菌水和大約 30 粒無菌玻璃珠。
b. 把 5 個平板疊放在一起，緊握平板，猛烈地搖動平板直至菌落重新懸浮（1~2 min)
c. 用無菌移液管從每個平板中吸取 5 ml 酵母懸液（傾斜平板) 把細胞懸液集中在 50 ml 的無菌錐形管中。
d. 繼續下面的 5 個平板，重復步驟 a~c。連續從 30 個平板中收獲酵母細胞，結果得到總體積為 150 ml 的酵母懸液，保存在 3 個 50 ml 管中。
相同的玻璃珠可以轉移到新的平板中，也可使用新的玻璃珠。同時洗脫的平板可以超過 5 個，只要手可以握住搖動即可。
平板可以重復使用許多次。收獲酵母細胞后，棄去殘余的瓊脂，沖洗平板，用乙醇擦拭，暴露于紫外燈下照射 10 min, 存儲備用。
2) 通過刮擦法收獲文庫
a. 戴著手套，把 30 個含有轉化體的 24 cmX24 cm 平板放在 4°C 環境中使瓊脂變硬（通常需要 2 h 甚至過夜）。
b. 把一個顯微鏡載玻片在乙醇中浸泡，然后灼燒消毒，用這個玻片輕輕地把酵母細胞從轉化平板上刮至 50 ml 的錐形管中。不斷地重新灼燒玻片或換用新的玻片（每 5~10 個平板)。
全部 30 個平板上的細胞通常匯集在一或兩個 50 ml 錐形管中。
平板可以重復使用許多次。收獲酵母細胞后棄去殘余的瓊脂，沖洗平板，乙醇擦拭，暴露于紫外燈下照射 10 min，存儲備用。
10. 如果需要，在每個裝有酵母細胞的錐形管中加無菌 TE(pH7.5) 或無菌水至 40~45 ml, 振蕩或翻轉試管懸浮細胞。
11. 使用臺式離心機 1000~1500 g(使用 Sorvall H1000B 轉子 2200~2700r/min) 室溫下離心試管 5 min, 棄去上清。
12. 重復步驟 10 和 11。
第二輪洗滌后，源自 1.5X106 個轉化體的細胞沉淀總體積應為 25 ml。
13. 重新懸浮緊的細胞沉淀于一倍體積的無菌甘油溶液中，合并不同管的內容物，徹底混合。
14. 分別轉移1ml 的細胞混合物于一系列無菌小離心管中，-70°C 凍存（至少 1 年內細胞保持穩定）。
如果直接在選擇培養基上進行平板培養（完成需要
5 h)，留一份不要凍存，進行下面的步驟。假設未凍存培養物的存活力 100%,—般情況下，酵母凍存時間少于一年，預期存活力將大于
90%。如果出現意外情況（例如：特別是在選擇培養基上鋪平板培養凍存細胞后沒有得到菌落)，通過在 CM(GlU)-Trp-His-Ura
上進行一系列的有限稀釋測量凍存細胞的存活力。
相互作用蛋白的篩選
轉化文庫的每一份鋪在亮氨酸缺乏的選擇培養基上來檢測其能否促進
LEU2 轉錄。并不是所有含有相互作用蛋白質的細胞在亮氨酸缺乏的選擇性培養基平板上都以 100%
的效率生長（Estojaketal.1995)。為了增加檢測到相互作用的概率，轉化文庫中獲得的每一個克隆都應該在選擇培養平板上出現 3~10
個能存活的酵母細胞。例如：最初得到 5x105 個克隆，1.5x106~5x106 個細胞就應該涂布在
2~5 塊平板上。雖然這樣操作可能導致過多地分離到相同的 cDNA, 但是它幫助我們保證了所有的初級轉化子在選擇培養基平板上至少呈現 1
個細胞。事實上，在一批相對較少的陽性克隆中，一條相同的 cDNA 的重復分離可被看作為一個特殊蛋白質間相互作用的標志。
15. 解凍一份轉化文庫酵母細胞（來自步驟 14)， 用 CM(Gal-Raff)-Ura-His-Trp 培養基按 1:10 稀釋，30°C 搖動培養酵母細胞 4 h 來誘導文庫中 GAL1 啟動子的轉錄。
16. 在適當數量的 100 mm CM(Gal-Raff)-Ura-His-Trp-Leu dropout 平板上分別培養 106 個細胞（或 50ul OD600 為 1.0 的培養物）。
重要：每個平板 105 個細胞為通常有效使用的最髙平板密度。更髙密度平板培養（例如：3X106。可能產生酵母細胞間的共棲現象，導致很高的背景生長。
17.30°C 培養平板 5d。
決定于所使用的單個誘餌蛋白，好的陽性相互作用單元候選菌通常在 5d 內長出克隆，大多數克隆在 4d 間出現。
18. 觀察平板的生長，出現克隆時對其加以標記。
一個好的策略（特別每生長出大量克隆時）是每天現察平板，并不需要馬上挑取克隆。而是第一天肉眼可以看到的充隆用實驗室記號筆以一個特定顔色的點在平板上標記它們的位置（例如：第 3 天為紅色）。每一天以不同的顏色筆標記剛剛長出的克隆（第 4 天為藍色等）。
19.
第五天，形成一個按每天出現的不同克隆分組的主板
(CM[Glu]-Ura-His-Trp)。如果出現許多明顯的陽性克隆，就有必要按照第二天、第三天和第四天出現的克隆分別生成一些單個的平板。為了為后面的步驟制作一個陰性對照，從檢測酵母細胞存活力的平板上隨機挑取
3~5 個克隆（請參見步驟 14
的說明），在測試主板上平行劃線培養。如果在后面的實驗步驟中使用多支管/蛙形器，要確信在合適的方格網中劃線以保證菌落與蛙形器上的輻條相對應（請參見圖
18-10)。
20.30°C 孵育平板直到斑點/菌落形成。
陽性相互作用的初次確定：β-半乳糖苷酶活性和亮氨酸需求的檢測步驟
21 和 22 檢測 lexAop-LEU2 和 lexAop-lacZ
報道基因的半乳糖誘導的轉錄活化。兩個報道甚因在半乳糖特異誘導的條件下同時表達，表明這種轉錄表型的出現是因為文庫編碼蛋白質的表達，而不是酵母宿主菌的突變。含有葡萄糖和亮氨酸的母板可用來提供檢測克隆。
21. 測定轉錄活化。
這個實驗可以利用牙簽重新劃線培養或利用多支管/蛙形器來進行，在分析大量陽性克隆時，多支管/蛙形器是非常有用的（有關蛙形器的詳細情況請參見圖 18-10)。
1) 通過直接劃線培養測定
a. 使用一個平頭牙簽分別在下面的 4 個平板上復制和主板上相同的柵格。使用相同的牙簽在四個平板上劃線培養單克隆，盡量在含有 X-gal 平板上劃制粗的酵母線條，而在亮氨酸缺乏的平板上劃制細的酵母線條。
CM(Glu/X-gal)-Ura-His-Trp 1 個平板
CM(Glu/Raff/X-gal)-Ura-His-Trp 1 個平板
CM(Glu)-Ura-His-Trp-Leu 1 個平板
CM(Glu/Raff)-Ura-His-Trp-Leu 1 個平板
b. 平板在 30°C 培養 3~4d。
X-gal 平板在 48 h 之內即會產生結果，最強的相互作用甚至 18 h 就會長出斑點。48 h 到 72 h 之間亮氨酸平板上不同的生長狀況通常很明顯。
2) 使用多支管/蛙形器測定
a. 在 96 孔微量滴定板上的 48 個孔中加入 25~30ul 無菌水。
b. 使用蛙形器從預先畫好柵格的主板上將菌斑同時轉移至微暈滴定板的孔中。輕輕搖動滴定板。
c. 再次使用蛙形器從微量滴定板中將酵母轉移至下面的平板上。這種方法可以把大致相同數量的細胞轉移到同一塊平板上。
CM(Glu)-Ura-His-Trp 2 個平板
CM(Gal)-Ura-His-Trp 1 個平板
CM(Glu)-Ura-His-Trp-Leu 1 個平板
CM(Gal/Raff)-Ura-His-Trp-Leu 1 個平板
d.
平板在 30°C 培養 3~4d。平板在培養 1d
后，采用氯仿覆蓋法（請參見第一階段結束處的替代方案：“通過氯仿覆蓋分析屮半乳糖苷酶活性”)，使用一個 CM(Glu)-Ura-His-Trp
平板和一個 CM(Gal)-Ura-His-Trp 平板測定 lacZ 報道基因的活化。
e. 繼續監控菌斑的生長：通常在 48 h 到 72 h 之間，在亮氨酸平板上的生長與在亮氨酸缺乏平板上的生長將產生明顯的不同。第二塊 CM(Glu)-Ura-His-Trp 平板可作為新的主板。
22. 解釋結果。如果具備下面的條件，菌落和它們包含的質粒被認作為第一輪的陽性充隆：
(1) 在 CM(Gal)-Ura-His-Trp 平板上的培養物 X-gal 分析呈現藍色。
(2) 在 CM(Glu)-Ura-His-Trp 平板上的培養物 X-gal 分析呈現白色或僅是淺藍色。
(3) 菌落在 CM(Gal/Raff)-Ura-His-Trp-Leu 平板上生長良好。
(4) 菌落在 CM(Glu)-Ura-His-Trp-Leu 平板上生長緩慢或根本不能生長。
第三階段 陽性相互作用的再次確定
材料
緩沖液和溶液
乙酸銨（7.5 ml/L)
氯仿
乙醇
異丙醇
裂解液
酶解酶 100T 以 2~5 mg/ml 溶解于拯救緩沖液中或β-葡糖醛酸酶 100000 單位/ml(Sigma）按 1:50 稀釋于拯救緩沖液中每次使用均需配置新鮮的溶液。
酚（早衡至 pH8.0)
拯救緩沖液
50 mmol/LTris-Cl(pH7.5)
10 mmol/LEDTA
0.3%β-巰基乙醇
每次使用均需配置新鮮的溶液。
SDS(10%,m/V)
STES 裂解液
100 mmol/LNaCl
10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
1 mmol/LEDTA
0.1%(m/V)SDS
TE(pH8.0)
酶和緩沖液
限制性內切核酸酶 Eco RI，XtoⅠ，Hae Ⅲ
凝膠
瓊脂糖凝膠
請參見步驟 5。
培養基
CM 選擇培養基
利用表 18-3 估計所需培養基的量，并根據表 18-9 制備所需的選擇培養基。
無氨基酸的酵母氮源（YNB) 分含或不含硫酸銨兩類，均有銷售。表 18-9 中假定 YNB 中含有硫酸銨。如果酵母氮源包裝瓶上說明制備培養基需加 1.7 g/L 酵母氮源，那么它就不含有硫酸銨，配制時毎升培養基中應加入 5 g 硫酸銨。
含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板
細菌基本培養基（色氨酸缺乏）
制備下列高壓滅菌貯存液：
1.20%(m/V）硫酸鎂
2.4 mg/ml 尿嘧啶
3.4 mg/ml 組氨脧
4.4 mg/ml 亮氨酸
5.20%(m/V) 葡萄糖
制備下列過濾除菌溶液：
6.50 mg/ml 芐青霉素
7.1% 鹽酸硫胺素
分別高壓滅菌下列兩種溶液：
8.15 g 瓊脂溶解于 800 ml 蒸餾水中
9.10.5 g 磷酸氫二鉀
4.5 g 磷酸二氫鉀
1 g 硫酸銨
0.5 g 檸檬酸鈉
160 ml 蒸餾水
將溶液 8 和 9 冷卻至 50°C，混合。迅速加入 1 ml 的溶液 1.10 ml 的溶液 2，10 ml 的溶液 3，10 ml 的溶液 4,10 ml 的溶液 5,lml 的溶液 6，以及 0.5 ml 的溶液 7。徹底混合終溶液，馬上倒制平板。
酵母選擇 X-gal 培養基
i. 按照表 18-9 所述，在 900 ml 水中制備基礎培養基，高壓滅菌后冷卻至 55°C
ii. 在另外一個瓶子中，7 g 磷酸氫二鈉和 3 g 磷酸二氫鈉溶于 100 ml 蒸餾水中, 高壓滅菌。
iii. 把兩種高壓滅菌溶液混合在一起，加入濃度為 100 mg/ml 的 X-gal 溶液（溶于 N,N-二甲基甲酰胺）0.8 ml, 倒制平板。
離心機和轉子
Sorvall RT6000 離心機，H1000B MPC 和 H6000A MPC 轉子（離心微量滴定板用）
專用設備
玻璃珠（直徑 0.45 mm, 無菌；Sigma)
微量滴定板（24 孔或 96 孔 [可選])
重復用移液管
可選，請參見步驟 1。
附加試劑
此方案的步驟 2 需要第 1 章方案 26 中列出的電穿孔試剤。
此方案的步驟 3 和 4 需要第 1 章方案 1 中列出的小量質粒 DNA 制備用試劑。
此方案中步驟 10 需要第 4 章方案 13 中列出的酵母 DNA 測序試劑。
載體、細菌和酵母菌株
適用于電穿孔的大腸桿菌 DH5a 或大腸桿菌 KC8(pyrF leuB600 trpC hisB463;CLONTECH)
請參見第 l 章，方案 26。
非特異性誘餌質粒
請參見步驟 6 說明。
PMW112，pRFHM-1
pBait(來自第一階段）
在 CM(Glu)-Ura-His-Trp 主極上生長的具適當表型的酵母克隆（第二階段步驟 21 已鑒定）
酵母菌株 EGY48
方法
陽性質粒的分離提供了兩種分離離散文庫質粒的方法。分離少量的菌落時，將細胞在 SDS 中裂解；分離大量的菌落時，細胞用酶解酶（zymolyase) 裂解。
(1) 從陽性菌落中制備細胞裂解物
1) 少量菌落的分離
一般來講，即使陽性菌落的數目數以百計，一些研究人員也寧愿用這種方法去逐步處理最初得到的全套陽性菌落，而在同時處理約
24~36
個或更少的菌落時，這種方法則是最為好用的。在通常的情況下，利用這個方案結束處的替代方案從普通生長的陽性菌落中區別出單一序列，不失為一個較為有效的方法。
a.
從 CM(Glu)-Ura-His-Trp 主板開始（第二階段步驟 21), 挑取在選擇培養基上呈現合適表型的菌落至 5 ml
的色氨酸缺乏的葡萄糖培養基中，30°C 過夜培養。在這種情況下省掉-Ura-His
篩選可以促進非文庫質粒的丟失，使分離希望得到的文庫質粒變得更為容易。
b. 室溫下使用小型離心機以最大轉速離心毎個培養液中的 1 ml 培養物 1 min, 在 200ul 的 STES 裂解液中重新懸浮沉淀，加入 100ul 直徑 0.45 mm 的無菌玻璃珠，劇烈振蕩試管 lmin。
c. 每個試管中加入 200ul 平衡酚，再次劇烈振蕩 1 min。
d. 室溫下使用小型離心機以最大轉速離心乳濁液 2 min, 分別把水相轉移至新的小離心管中。
e. 每個水相中加入 200ul 的平衡酚和 100ul 的氯仿，振蕩 30s。室溫下使用小型離心機以最大轉速離心乳濁液 2 min, 分別把水相轉移至新的小離心管中。
f. 每個水相中加入兩倍體積（400ul) 的乙醇，翻轉混合，-20°C 冷凍試管 20 min,4°C 條件下使用小型離心機以最大轉速離心 15 min 來回收核酸。
g. 棄去上清。用冷的 70% 乙醇洗滌沉淀，真空條件下使沉淀大致干燥后，在 5~10ul TE(pH8.0) 中重新懸浮每份沉淀。進行步驟 2。
2) 大量菌落的分離
下面制備多批 DNA 的實驗方法是由 Steve Kron(芝加哥大學）建立的，在它是對 Manuel Claro(巴黎基因技術分子實驗室）最初建立的實驗方案的一種放大。需要帶有平板固定器（或托盤、支架）的冷凍離心機和可以重復使用的移液管。
a. 在 24 孔微童滴定板的每個孔中加入 2 ml 2xCM(Glu)-Trp 培養基。用牙簽從主板上挑取假定的陽性克隆到微量滴定板的孔中（第 2 階段步驟 21),30°C 搖動微量滴定板培養過夜。
使用 2X 基礎培養基增加了酵母的產通常可以方便地處理 4 個平板，并在一個離心機中同時離心。
b.
使用帶有平板支架的離心機，4°C、1500 g(使用 Sorvall H1000B MPC 轉子 3000r/min) 離心 5
min。用手甩動平板去掉上清液，平板正面向上放置，搖動或輕輕振蕩平板使細胞沉淀重新懸浮于保留的培養液中。每個孔中加入 1 ml 水輕輕播動平板。
加入新的溶液之前，細胞沉淀最容易重新懸浮于殘余的液體中。可以使用重復用移液管添加溶液。
c. 如步驟 b 般離心，甩掉上清液，重新懸浮細胞沉淀于殘留的上清液中，加入 lml 的拯救緩沖液。
d. 如步驟 b 般離心，甩掉上清液，重新懸浮細胞沉淀于平板上少量的殘留上清液中，每個孔中加入 25ul 的裂解液，搖動或振蕩平板，在旋轉搖床上 37°C 培養平板（需加蓋）約 1 h。
裂解液使用前不需要完全溶解。經過
1
h，酵母細胞凝結為白色的沉淀時，即明顯可見裂解現象。酵母菌株對裂合酶的敏感性各不相同。如果裂解現象出現得很快，那么就使用較少的裂合酶。如果裂解處理的時間過長,
過多的部分溶解細胞墊將可能污染最后的材料。可以通過在相差顯微鏡下檢査細胞來判斷裂解情況。活細抱是帶有黑的暈圈的白色，死細胞是均勻的灰色。裂解會把細胞中的顆粒內容物釋放到培養基中。一旦細胞大部分都變成灰色并且許多細胞已經破裂，即可假定為許多質粒已經釋放了出來。
e. 每個孔中加入 25ul 的 10%SDS。搖動平板完全溶解沉淀。室溫下把平板在桌面上放置 lmin。1 min 后，平板上的孔中應為清亮的、稍微黏稠的溶液。
f. 每個孔中加入 l00ul 的 7.5mol/L 乙酸銨。輕輕振蕩平板，然后-70°C 或-20°C 放置 15 min 直到裂解物被冷凍為止。
乙酸鹽的加入導致了細胞碎屑和 SDS 塊狀沉淀的形成。冷凍步驟促進了大揚桿菌轉化抑制物的去除。
g. 從冰箱中取出平板。一旦開始融解，4°C、3000 g(使用 Sorvall H6000A MPC 轉子 3800r/min) 離心 15 min, 轉移得到的 100~150ul 的清亮上清液至新的 24 孔板中。
要點：一般來說，沉淀材料對上清液的某些污染不能避免。然而為了保證純度，最好犧牲部分產物。
h. 每個孔中加入約 0.7 體枳的異丙醇，搖動平板混合溶液，室溫下沉淀核酸 2 min。按照步驟 g 離心，用手甩動平板去掉上清液。
異丙醇加入后馬上出現渾濁的細小沉淀。
i. 每個孔中加入 1 ml70% 冷乙醇，晃動平板。然后 4°C、3000 g(使用 Sorvall H6000A MPC 轉子 3800r/min)5 min, 用手甩動平板去掉上清液，翻轉平板，讓孔印在紙巾上，讓平板在空氣中干燥。
j. 每個孔中加入 100ul 的 TE(pH8.0)。晃動平板，然后放在桌面上放置幾分鐘，直到沉淀完全掖解。把制備品轉移至小離心管或 96 孔板孔中-20°C 保存。進行步驟 2。
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