原位PCR實驗步驟

原位PCR實驗步驟，原位PCR是原位雜交細胞定位和PCR的高靈敏度相結合的技術，使得靶基因檢測有了極大的改進。此技術是在細胞（爬片、甩片或涂片）或組織（石蠟、冰凍切片）上直接對靶基因片段進行擴增，通過摻入標記基團直接顯色或結合原位雜交進行檢測的方法。

一、組織切片和細胞樣品的制備

試劑與配置

10%福爾馬林；二甲苯；PBS

操作方法

1. 用10%福爾馬林固定組織8~15hr，石蠟包埋，切片（4μm），將切片置于新鮮的二甲苯中處理5min，放入無水乙醇中浸泡5min，取出，空氣干燥；

2. 對于培養細胞，可直接制備爬片，也可有PBS洗細胞一次，加10%福爾馬林靜置，用橡膠刮下細胞；用PBS洗細胞兩次，2000rpm×3min，用5ml PBS重懸細胞，即可用甩片機甩片或直接吸50μl點在載玻片上。

二、切片預處理（蛋白酶消化）

試劑與配置

0.1mol/L Tris-HCl (pH7.4)

緩沖液A：0.1mol/L Tris-HCl (pH7.4)，0.3% Tween-20，0.5% NP-40

蛋白酶K：20-50μg/ml，溶于TE中

原位PCR實驗步驟，操作方法

1. 干燥后的切片置于0.1mol/L Tris-HCl (pH7.4)中，室溫孵育5min；

2. 浸入緩沖液A中，室溫孵育10min；

3. 滴加20μl蛋白酶K液于標本上，在濕盒中37℃孵育20min；

4. 在室溫下，用0.1mol/L Tris-HCl (pH7.4)漂洗兩次，每次5min。

三、原位擴增（以標記生物素為例）

試劑與配置

PCR反應緩沖液：兩種引物各100pmol，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μmol， Bio-dUTP 50mol，1×PCR緩沖液；

Tag酶：5U/μl

緩沖液B：0.01mol/L PBS，0.1% Triton-X100

指甲油（市售）

無水乙醇

原位PCR實驗步驟，操作方法

1. 切片用1×PCR緩沖液平衡3次，每次5min；

2. 用濾紙吸去切片上多余的液體，置60℃，每片加入30μl PCR反應緩沖液，5U Tag酶，用蓋玻片封片，四周封以指甲油，防止蒸發；

3. 94℃變性5min，按下列條件（94℃×2min，55℃×2min，72℃×3min）循環20~25次后，72℃延伸5min；

4. 玻片浸入無水乙醇中10min，以軟化指甲油；

5. 用刀片撬開蓋玻片并除去；

6. 用緩沖液B漂洗兩次，每次3min；

7. 用無水乙醇固定5min，并吹干。

四、檢測（以ABC法為例）

試劑與配置

緩沖液C：0.1mol/L Tris-HCl (pH7.5)，0.1mol/LNaCl，2mmol/L MgCl2， 0.5% Triton-X100

封閉液：3%BSA（溶于緩沖液C中）

顯色液：0.05%DAB，溶于0.05mol/L Tris-HCl (pH7.4)，臨用前每10ml加30%過氧化氫50μl

1%鹽酸酒精液

蘇木素染色液

，操作方法

1. 用30μl 3%BSA滴加在玻片上，封閉1hr；

2. 用緩沖液C簡洗1min，每片滴加ABC復合物20～30μl，室溫放置40min；

3. 緩沖液B室溫漂洗3次，每次15min；

4. 滴加顯色液于玻片上，鏡下觀察控制顯色時間（一般7～14min）；

5. 流水洗片，浸入蘇木素液中復染30s，1%鹽酸酒精分化（提抽2次）；

6. 常規脫水、透明、封片，鏡下觀察。