單鏈cDNA的合成實驗

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

去除 RNA 酶的雙蒸水

10XRT-PCR 緩沖液（去除 RNA 酶的雙蒸水，100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl₂)

2. 酶和酶緩沖液

MMLV 逆轉錄酶（100~200U/ul)

SUPERaseINRNA 酶抑制劑（20U/ul;Ambion)

3. 核酸和寡核苷酸

dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四種 dNTP)

隨機引物（5umol/L)

總 RNA(達到 2.5ug)

4. 實驗器材

薄壁的 PCR 管

二、方法

1. 在冰上加 2ul50umol/L 的隨機引物到薄壁的 PCR 管中（一個反應一管)。

2. 加入 2.5ug 的總 RNA。

3. 加入 4ul 的 10 mmol/LdNTP 混合物。

4. 添加去除 RNA 酶的雙蒸水（RNaSe-freeH₂0)，使體積達到 16ul。

5.70°C 加熱 10min, 變性二級結構，然后立即放在冰上。

6. 加 2ul 的 10XRT-PCR 緩沖液。

7. 加1ul 的 20U/ulSUPERaselN。

8. 加1ul 的 100~200U/ulMMLV 逆轉錄酶。

9.42°C 溫浴 1h。

10.95°C 加熱10min, 滅活逆轉錄酶。

11. 繼續擴增步驟或停止反應，-2°C 儲存。