利用單拷貝基因組探針及染色體彩繪進行熒光原位雜交

SSC D-PBSA 糖原 RNase 多聚甲醛 甲酰胺

固定液 乙醇 雜交緩沖液 標記探針 橡膠乳黏劑 封固劑

含有重復序列探針的沉淀：

大分子量黏粒探針往往含有重復序列，如果在雜交前不能封閉這些序列，將導致嚴重的非特異性雜交背景。人 Cot1 DNA 富含重復序列，可對黏粒的重復序列產生競爭性抑制，故雜交中加入 Cot1 DNA 可消除上述影響。在下述的操作步驟（b  )中，可將 Cot1 DNA 一并沉淀。

(a) 就20 μl 的缺口平移標記反應體系而言，取 0.5，mol/L EDTA 1 μl，4 mol/L LiCl 2.5 μl，糖原 1 μl，100~1000 倍過量的人 Cot1 DNA ( Invitrogen ) 及乙醇 100 μl，與標記探針混合。

(b) 將其置于干冰上 30 min 或 -20 ℃ 過夜，使之沉淀。

(c) 在離心機中離心 15 min，以沉淀 DNA 。

(d) 用 70 % 乙醇洗滌沉淀。

(e) 離心使 DNA 再沉淀，室溫晾干 DNA 。

(f) 以雜交緩沖液中重新稀釋 DNA，濃度為 2~10 ng/μl。

不含重復序列探針的沉淀：

與前述方法基木相同，但需要將 Cot1 DNA 從沉淀中去除。

探針變性：

(a) 對于含有重復序列的探針，需要用 Cot1 DNA 將其封閉。將探針混合液加熱至 70°C 10 min。將探針混合液 37°C 放置 1 h，然后涂在載玻片上。

(b) 對于不含重復序列的探針，將探針混合液加熱至 70°C 10 min，然后將其在冰上冷卻 10 min。

檢測探針的 TBST 緩沖液，含 0.05% Tween20 ( 吐溫），以 0.1 mol/ L Tris，0.15 mol/L NaCl ( pH 7.5 ) 配制

甲酰胺，以1X SSC 配成 50%

抗體：

(a) 第一抗體（一抗），如：抗地高辛或抗生物素的羊多抗血清；滴定法參見產品說明（Roche)

(b) 第二抗體（二抗），如：FITC-耦聯的驢抗羊 IgG (JacksonlmmunoresearchInc.)

(c) 用含 3% 牛血清白蛋白（BSA ) 的 TBST 稀釋抗體

染色體的制備與變性：

1. 用規范技術制備中期靜止細胞（見方案16. 7 及方案27. 5)，將固定的細胞滴至載玻片上，用鉆石刻筆做好區域標記。

2. 用新配制的甲醇及乙酸（3 : 1 ) 固定液再次固定細胞 1 h，然后晾干載玻片。

3. 于室溫下用 2X SSC 淋洗玻片 2 min。

4. 于 37°C 條件下，用含 100 μg/ml RNase 的 2X SSC 溫育 1 h。

5. 用 D-PBSA 淋洗。

6. 室溫下用新制備的含 1 % 多聚甲醛的 D-PBSA 再固定 10 min (此過程為可選步驟）。

7. 用 D-PBSA 淋洗。

8. 用 70 % 和 100% 乙醇進行兩輪脫水，每次 2 min，然后風干載玻片。

9. 于 70°C 條件下，用含 70 % 甲酰胺 2X SSC 變性染色體 2~4 min (從 2 min 開始嘗試，以確定實驗的適宜時間），在使用 70% 甲酰胺前先確信其溫度為 70°C。

10. 用冰冷的 70% 乙醇分次淋洗玻片。

11. 重復步驟 8 中的脫水操作，并且晾干玻片。

12. 此時的染色體可用于雜交反應。

雜交：

13. 在鋪布細胞的區域內滴加 10 μl 變性探針（標記探針：大分子量的黏粒克隆很適于作為檢測單拷貝基因的探針，但 cDNA 探針同樣可以使用。采用商品試劑盒，將 DNA 用缺口平移法標。Roche (以前是BoehringerMamiheim) 生產的缺門平移試劑盒可用于生物素或地高辛摻人，詳情可參照產品說明。），用 22mm X 22 mm 的蓋玻片覆蓋此區域。

14. 用橡膠乳黏劑將蓋玻片四周封閉住。

15. 載玻片在 37°C 飽和濕度的孵箱中過夜。

探針檢測：

16. 次日取出載玻片，浸入 2X SSC 中，揭去蓋玻片（室溫下），清除外周的膠黏劑，將載玻片置于一個 Coplin 瓶中。

17. 42°C 條件下，用含 50 % 甲酰胺的 1X SSC 浸泡載玻片 2 次，每次 10 min。

18. 42°C 條件下，用 2X SSC 液淋洗載玻片2 次，每次 10 min。

19. 用 TBST 淋洗。

20. 37°C 條件下，將載玻片在含 3% 牛血清白蛋白的 TBST 中孵育 30~60 min，以封閉非特異性結合。

21. 將一抗（第一抗體）滴加到載玻片上，每個載玻片用 100 μl 抗體，用 Parafilm 封蓋每個載玻片。

22. 37°C 條件下，孵育載玻片 1 h。

23. 室溫下，用 500 ml TEST 淋洗載玻片。

24. 將 3%  BSA/TBST 稀釋的熒光素耦聯二抗液滴加到載玻片上，二抗的使用效價（滴度）參見產品說明或者自己摸索。

25. 37°C 條件下，孵育 30 min。

26. 室溫下用 500 ml TBST 淋洗 30 min。

27. 用含 0.8 μg/ml 的二氨基苯基吲哚（DAPI ) 和（或）含 0.4 μg/ml 碘化丙錠(PI) 的 TBST 復染 10 min，用抗消色玻片封蓋。

28. 通過相應的濾片組合，用熒光顯微鏡觀察載玻片上的細胞。

抗體的組合使用一定要正確， 例如：如果使用抗地高辛的羊多抗血清作為第一抗體， 那么第二抗體就必須是 FITC -耦聯的驢抗羊 IgG 抗體。