分子互作方法之BIAcore！

BIAcore是一種基于光學表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance，簡稱SPR）原理的用于分子互作分析的常用方法。

因為其準確性高、重復性好、應用廣泛，目前SPR原理用于藥物分析的方法已經被錄入中國、美國、日本的藥典，基于BIAcore方法的文獻也已經超過了15000篇。那這個方法為什么會這么優秀，我們來給大家介紹一下！

SPR其實是一個運用物理光學原理，來檢測因為分子結合導致的介電常數的變化引起的角度的變化，角度的變化會導致響應值的變化。

變化會實時的從傳感圖檢測出來：

從上面的傳感圖也可以看出，SPR的方法不僅可以檢測是否有特異性的結合，還可以通過數據分析軟件獲得分子間的結合速率常數（association rate constant，ka）、解離速率常數

（dissociation rate constant，kd）、平衡解離常數（dissociation equilibrium constant，KD）等，從而可以得到親和力、濃度、動力學、熱力學等參數，這些在藥物研發中非常重要的數據，所以在SPR 技術被正式收錄到中國、美國和日本藥典后，越來越多的被應用到藥物的研發和質控中。

那接下來我們通過一些文獻來看一下BIAcore在藥物研發中主要應用的方向：

01、特異性分析

目標分子與靶分子之間是否發生特異性結合？

分子互作最基本的檢測參數，我們可以利用特異性結合在藥物研發過程中來篩選和藥物分子特異性結合的藥物靶點受體。

BIAcore的優勢在于可以重復使用作為受體的靶點，只需要進行合理的再生，就可以高效的進行多種分子的篩選驗證。

在下面這篇文獻當中，作者就是想驗證哪些分子可以和腫瘤靶向分子EGFR特異性的結合并且具有較好的特異性，可以作為潛在的藥物作用靶點。

所以在實驗之初，作者通過軟件模擬篩選結合位點，然后用BIAcore進行驗證，最后篩選出有潛力的結合位點，再進行下游的實驗分析。

經證明，只有小分子NSC51186能特異地與EGFR結合，如下圖為從上到下的曲線依次是濃度由高到低的小分子NSC51186在EGFR表面流過的響應值（扣除了BSA參比），響應值的變化說明了有特異性的結合。（未結合的未展示）

BIAcore 分析 NSC51186 和 EGFR 之間的相互作用 EGFR 固定于芯片上不同濃度的小分子 51186（250, 350, 400, 450, 475, 500nM ）依次流過EGFR表面

參考文獻：鄧宏偉,等. 生物化學與生物物理進展, 2005, 032(002):180-186.

02、親和力測定

配體與分析物之間的結合強弱？

親和力，可以用解離平衡常數（KD）反映，是一個描述配體和分析物分子之間的結合強度的參數，對于生物藥物研發來說，親和力是判斷藥效的關鍵功能屬性之一，在生物藥研發的過程中，抗體親和力測定意義重大，可以為新型抗體偶聯藥物開發提供依據。

在下面這篇文章之中，作者就是通過 SPR 法測定單抗及其相對應的抗體偶聯藥物與受體間的相互作用，計算其親和動力學。

抗體—藥物偶聯物（ADC）是特異性靶向腫瘤抗原的抗體與細胞毒性藥物連接的一類治療藥物，ADC可以提高治療指數，因為它們被設計成特異性遞送細胞毒性劑對腫瘤細胞，并限制對正常細胞的附帶損傷。

目前僅有上市的T-DM1就是由曲妥珠單抗、高活性抗有絲分裂的美登素衍生物DM1通過交聯劑琥珀酰亞胺酯偶聯形成的ADC，唯一一個用于與HER2受體結合治療實體瘤的。文中作者討論的就是其他的ADCs的在治療過程中起作用的可能性，作者挑選了265SD、P-DM1、P-MMAE、WBP26這些正處于臨床前試驗階段的正在研發的新藥。

文章利用 Biacore T200 檢測抗體偶聯藥物及單克隆抗體與受體 HER2的KD值，如果數值在10^（-10）左右，就認為有很高的親和力，活性高。

首先將抗人 IgG(Fc)抗體氨基偶聯到 CM5 傳感芯片表面的方式，應用單循環動力學（SCK）測定抗體偶聯藥物及單抗與受體的親和動力學，SPR 實時監測到的供試品與 HER2 結合解離的 SPR 時間變化曲線，用1:1 Lamgmuir 模型描述擬合的情況，對所得結合曲線進行綜合分析（如下圖的單抗 Tratuzumab和抗體偶聯藥物 T-DM1）。

然后再用Biaevaluation 分析軟件處理后，平衡解離常數 KD（親和力）可利用軟件得出的解離速率常數 kd 和結合速率常數 ka計算得出（數據見下表）。通過親和力初步判斷哪些ADC適合進行后面的藥物研發實驗。

單抗 Tratuzumab 與受體 HER 2 的 1:1 Lamgmuir 結合動力學曲線

抗體偶聯藥物 T-DM1 與受體 HER 2 的 1:1 Lamgmuir 結合動力學曲線

單抗及抗體偶聯藥物與受體 HER 2 的親和常數

參考文獻：張茂桃. (0). 基于HER2靶標的抗體偶聯藥物(ADCs)內吞機制研究. (Doctoral dissertation).

03、動力學分析

兩分子結合和解離的速率快慢？

動力學在分子互作中是用來描述分析物與配體之間結合的速率（ka）和解離的速率（kd），是表征分子結合很重要的參數。在藥物研發過程中，我們可以通過檢測結合或者解離速率來判斷結合的藥物分子作用的時間和效果。

例如這篇文獻當中作者對HIV蛋白酶突變與抑制劑耐受性的關聯性進行研究，通過BIAcore方法檢測不同突變體和抑制劑的結合的動力學和親和力，來探究影響抑制劑作用的關鍵因素。

為了研究抑制劑的結構和耐藥性之間的關系，作者做了關于HIV-1蛋白酶耐藥突變體和一系列抑制劑之間的研究。突變體是根據已知的臨床常用抑制劑耐藥突變體，并結合蛋白酶中的氨基酸的位置進行設計。如下圖所示，作者構建了單個和多個位點的突變，突變的氨基酸偉G48V，V82A，I84V和L90M。

接下來，作者通過Biacore檢測野生型/突變的HIV蛋白酶和抑制劑之間的親和力和動力學參數。結果如下方的表格所示。

通過進一步對結合動力學進行分析，作者發現和野生型相比，突變體和抑制劑之間的解離速率明顯增加。

Fig.2. 野生型/突變體和抑制劑之間結合動力學分析

作者進一步對實驗結果進行了討論和分析。Leu90是一個位于二聚體表面的氨基酸殘基，替換為Met降低了二聚體的穩定性。本次實驗表明，Leu90替換為Met，對抑制劑的結合具有非特異性的作用，由于解離速率增加而親和力減弱。

Gly48位于蛋白酶的flap區，對于結合位點成型和酶復合體穩定性具有重要的作用，這個位點突變之后，對saquinavir形成耐受性，解離速率增加。而82和84位點位于活性位點，突變之后引起親水性和范德華力作用的減少，數據表明結合和解離速率的改變引起親和力的減弱。

參考文獻：Shuman , et al. Antiviral Research, 2003, 58(3):235-242.

總結：SPR技術在藥物研發中運用的越來越廣泛，也說明了SPR方法在藥物研發中重要的位置。本文旨在拋磚引玉，簡單的介紹哪些功能可應用于生物藥研發當中。