一、原理
電泳遷移率分析,也可稱作遷移電泳,凝膠電泳分析,凝膠遷移率分析,條帶移動分析或者凝膠阻滯分析,這種方法常用來研究蛋白質-DNA,蛋白質-RNA的相互作用,對照泳道(不含蛋白質的DNA/RNA探針)將出現單一的條帶。如果蛋白質與片段結合,形成大的復合物,因此在凝膠上遷移的速度慢從來遷移率減低。
二、材料和試劑
1. DTT(Promega)
2. poly-dIdC(Sigma)
3. 32P-labeledprobe
4. BSA(Sigma)
5. 常用化學品試劑(Sigma)
6. 濾紙(GEHeathcare)
三、步驟
1. 制備聚丙烯酰胺凝膠
(1)裝配板,墊片,及夾具。用1%瓊脂糖封閉底部與側面,防止膠漏。
(2)5%聚丙烯酰胺凝膠的制備
| Platesize | Large | Medium |
| H2O | 78 mL | 39 mL |
| 10×TBE | 5 mL | 2.5 mL |
| 30%丙烯酰胺(19:1) | 16.6 mL | 8.4 mL |
| 10%過硫酸銨 | 1000 uL | 500 uL |
(3)混勻,盡量減少泡沫的形成。加100 uL/50 uLTEMED。
(4)混勻后倒入膠板,插梳子。凝膠聚合大概需10分鐘。
(5)聚合后,凝膠可用塑料膜包裹后4℃保存。
2. 制備5×結合緩沖液。
3. 結合反應
1 uL poly-dIdC(1ug/uLinTE)
2 uL 5x結合緩沖液
1 uL 標記探針
如有必要加1uL未標記的DNA探針片段(如競爭試驗)
0.1 uL 100xBSA
若干體積(uL)的核提取物(5ug總蛋白)
加H2O到10 uL 總體積
室溫孵育30分鐘。如有必要可再加入蛋白抗體,使阻滯更加明顯,加抗體后再室溫孵育30分鐘。
4. 在結合反應孵育的過程中,將膠裝在電泳槽,在0.5×TBE電泳緩沖液,150伏電壓下,預跑30分鐘,之后上樣,150 V 電泳2小時。
5. 制干膠(可選):將膠轉移到濾紙上。膠上蓋濾紙,80℃真空干燥器中干燥1-2小時。
6. 壓片曝光在暗室中將膠放在暗盒中,放膠片。在-80℃條件下曝光。
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