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  • 發布時間:2019-11-13 09:59 原文鏈接: 凝膠阻滯

    一、原理

    電泳遷移率分析,也可稱作遷移電泳,凝膠電泳分析,凝膠遷移率分析,條帶移動分析或者凝膠阻滯分析,這種方法常用來研究蛋白質-DNA,蛋白質-RNA的相互作用,對照泳道(不含蛋白質的DNA/RNA探針)將出現單一的條帶。如果蛋白質與片段結合,形成大的復合物,因此在凝膠上遷移的速度慢從來遷移率減低。

    二、材料和試劑

    1.  DTT(Promega)

    2.  poly-dIdC(Sigma)

    3.  32P-labeledprobe

    4.  BSA(Sigma)

    5.  常用化學品試劑(Sigma)

    6.  濾紙(GEHeathcare)

    三、步驟

    1.  制備聚丙烯酰胺凝膠

    (1)裝配板,墊片,及夾具。用1%瓊脂糖封閉底部與側面,防止膠漏。

    (2)5%聚丙烯酰胺凝膠的制備


    Platesize Large Medium
    H2O 78 mL 39 mL
    10×TBE 5 mL 2.5 mL
    30%丙烯酰胺(19:1) 16.6 mL 8.4 mL
    10%過硫酸銨 1000 uL 500 uL

    (3)混勻,盡量減少泡沫的形成。加100 uL/50 uLTEMED。
    (4)混勻后倒入膠板,插梳子。凝膠聚合大概需10分鐘。
    (5)聚合后,凝膠可用塑料膜包裹后4℃保存。

    2.  制備5×結合緩沖液。

    3.  結合反應

    1 uL  poly-dIdC(1ug/uLinTE)

    2 uL  5x結合緩沖液

    1 uL  標記探針

    如有必要加1uL未標記的DNA探針片段(如競爭試驗)

    0.1 uL  100xBSA

    若干體積(uL)的核提取物(5ug總蛋白)

    加H2O到10 uL 總體積

    室溫孵育30分鐘。如有必要可再加入蛋白抗體,使阻滯更加明顯,加抗體后再室溫孵育30分鐘。

    4.  在結合反應孵育的過程中,將膠裝在電泳槽,在0.5×TBE電泳緩沖液,150伏電壓下,預跑30分鐘,之后上樣,150 V 電泳2小時。

    5.  制干膠(可選):將膠轉移到濾紙上。膠上蓋濾紙,80℃真空干燥器中干燥1-2小時。

    6.  壓片曝光在暗室中將膠放在暗盒中,放膠片。在-80℃條件下曝光。


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