1、 將清潔干燥并經滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號,用微量移液槍分別加入DNA 1μg和相應的限制性內切酶反應10×緩沖液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內溶液混勻后加入1μl酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個實驗成敗的關鍵,要防止錯加，漏加。使用限制性內切酶時應盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。
2、 混勻反應體系后,將eppendorf管置于適當的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保溫2-3小時,使酶切反應完全。
3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應,置于冰箱中保存備用。