（1）細菌培養 37℃厭氧環境下培養24～48小時。培養結果陽性，還應進行毒素鑒定，由于少數正常人可攜帶難辨梭狀芽胞桿菌，而此種菌株并不產生毒素。
（2）毒素鑒定 為診斷假膜性小腸結腸炎的金標準。主要采用組織細胞培養法，該法最為敏感和特異，但臨床實施較困難。酶聯免疫吸附法（ELISA）雖不及細胞培養敏感，但快速、簡便、經濟，現已應用于臨床。
（3）抗毒素中和試驗 難辨梭狀芽胞桿菌毒素的細胞毒作用可被難辨梭狀芽胞桿菌抗毒素中和，將抗毒素稀釋后在室溫或37℃時即可出現中和現象。
