（四）染色原理及步驟
1．基本原理 酶標抗體與熒光色素標記抗體的染色相同，亦分直接法和間接法。直接法是將酶直接標記在每一抗體上，間接法是將酶標記在第二抗體上，檢測組織細胞內的特定抗原物質。間接法所用的第一抗體是對組織細胞內某種抗原的特異性抗體（80%～90%的抗血清系由家兔制得，而絕大數單克隆抗體系由小鼠制備）；第二抗體則為第一抗體（家兔/小鼠的IgG）的抗體。所以，只要不同的第一抗體均來自同一種屬，同一標記的第二抗體就能用來顯示其不同特異性抗原的存在，這樣可避免了直接法中標記每一種第一抗體的麻煩，并且提高了方法的敏感度。目前的ICC染色中，以間接法為常用，在此著重介紹間接法的染色程序。
2．染色程序
（1）切片準備：見第一章 。
①石蠟切片經二甲苯或Hemo-De脫蠟，下行酒精至水。②固定/無固定新鮮組織冰凍切片，室溫干燥2h以上。
（2）未固定的新鮮組織切片，丙酮固定20～30min(fretrieval )，簡而言之，即用蛋白酶處理，去除固定劑交聯造成的空間遮蔽（室溫），風干15～30min.;已固定的組織冰凍切片及石蠟切片，根據需要可進行組織抗原的激活。
（3）用蠟筆沿切片周圍勾劃一道屏障，以避免孵育液流失及孵育過程中切片干燥，同時也能節 省抗體用量，保持切片與抗體的充分接觸，風干。石蠟切片（滴少量PBS，以防其干燥）直接進行步驟（6）。
（4）切片經PBS或其它緩沖液漂洗3次，每次2min，溶解除去冰凍切片上的OCT包埋劑。但應用ALP標記抗體時，禁用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗，因后者可使ALP失活。
（5）根據需要，用甲醇+0.3%H2O2處理切片15～30min（室溫），封閉內源性過氧化酶的活性。應用ALP標記抗體時，此步可省略。
（6）PBS漂 洗2min（共兩次），移至0.05%Tween-20/PBS(或0.22～1%Triton X-100)中5min（室溫）。Tween-20為一種表面活性劑，除具有清潔作用外，還可增加組織的通透性，有利于組織細胞內抗原的顯示。
（7）4%Block Ace或0.1%～1%BSA濕盒內孵育15～25min（室溫），然后；輕輕棄去孵育液（不沖洗）；以阻斷組織與抗體的非特異性結合，降低背景染色。
（8）根據需要，可用1/5～1/30正常來活兔/羊血清孵育15～20min（室溫，以酶標抗體相同種屬正常血清為宜，最好是同一動物免疫前的血清）。或者省略此步，而在稀釋酶標抗體時，加入1%～2%的同一種屬正常血清。
（9）輕輕棄去孵育液， 滴加含0.2%BSA/0.05 NaN3/PBS稀釋的第一抗體（抗體用量：每張切片一般為50～80μl），濕盒內孵育1～2h（20～25℃）；免疫電鏡用標本，4℃過夜。
（10）PBS充分沖洗（3次×2min），以去除切片上非特異吸附的抗體。應用不同的第一抗體或同時進行對照標本染色時，需分別沖洗，以防相互污染。
（11）經0.05%Tween-20/PBs 2min后,滴加含0.2%BSA/1%正常血清/PBS稀釋的HRP酶標記的第二抗體,濕盒內孵育45～60min(20～25℃)。
（12）PBS漂洗（3次×2min）,此處不需分別漂洗，因所有切片均系同一酶標抗體孵育。
（13）未固定或固定較弱的冰凍切片，此處可輕微固定。首先將切片從PBS移至TBS中3～5min，去除PBS，以防其中的磷酸與后面使用的固定液中的CaCl2形成磷酸鈣而沉淀后，然后用Baker氏固定液固定5min（室溫）此時輕微固定，既不影響抗原抗體結合，又較有利于保存第一抗體孵育前的組織抗原，尤其適用于單克隆抗體的ICC染色。
（14）呈色：HRP標記抗體的呈色液為0.01%～0.1%H2O2 0.01%～0.05% DAB 0.05～0.1mol/L Tris –HCl(pH7.4)。切片經PBS或Tris-HCl液漂洗后，置上述呈色液內10～15min（室溫、暗處），亦可鏡下控制顯色速度。終產物為棕褐色沉淀。用于電鏡觀察的標本，呈色3～5min即可，防止DAB終產物向周圍擴散，影響超微結構定位。另外，顯色液應于用前新鮮配制，避免DAB本身氧化變質。新配制的DAB為無色透明液體。若DAB液已氧化變為紫紅色，應換新藥重新配制。
（15）將切片置流水中（僅光鏡觀察）或PBS（電鏡標本）內，終止呈色反應。
（16）未固定的冰凍切片，可用1%戊二醛-PBS液加強固定5～10min（室溫），流水沖洗。
（17）細胞核輕度染色，以甲基綠和蘇木精為常用。前者細胞核呈綠色，與HRP/ALP等終產物對比度尤佳，但不適于微波照射的標本。蘇木精是組織學、病理學研究中普遍應用的核染色方法，與HRP、ALP的終產物對比度比較好。
（18）DAB呈色的標本，可以系列酒精脫水、Hemo-De透明、DPX封固。其它物質呈色的標本，在有機溶劑中沉淀物易溶解，褪色，所以用水溶性封固劑如明膠甘油等封固，次日，于蓋玻片周圍涂少許女士用指甲油，可使切片保存時間更長。
（19）鏡檢、觀察記錄同一般形態學研究。
（20）免疫電鏡用標本，經OSO4后固定，按電鏡標本要求處理（參見本書第七章 ）。亦可OSO4固定，噴碳（Carbon Coating）,利用掃描電鏡觀察抗原的存在部位。
3．酶標抗體及發色劑的選擇
HRP特異底物為H2O2,在分解H2O2過程中,與H2O2形成復合物,無電子供體存在時,反應不再進行,當電子供體存在時,迅速生成水,酶被還原,電子供體被氧化環化,形成苯乙胼聚合體(圖4-2)。在酶反應部位，形成不溶性棕褐色沉淀，與組織對比清晰。
圖4-2 DAB反應產物形成過程
HRP催化的酶促反應第一步是特異性的—酶催化底物H2O2，其余反應是非特異的，可用各種電子供體介導，所以選用不同的電子供體，可使終產物呈不同顏色，例如：CN（4—Chloro—1– N aphthol）為藍黑色，TMB（Tetramethyl—Benzidine ）為深藍色，AEC（3—amino—9– ethyl--carbazole）為紅色。市售試劑盒所配顯色液以AEC居多，室溫下較穩定，但不能進行脫水等處理，且時間長易褪色。DAB是廣泛應用的電子供體之一，較敏感，切片可脫水透明、半永久保存，且終產物具有嗜餓性，經O2O4處理，電子密度增加，適于電鏡下確定抗原的存在部位。但是DAB被認為可能具有致癌性，所以應盡量減少吸入和接觸次數，最好將DAB制成10倍貯存液，分裝于-20℃保存，應用時稀釋、過濾。與DAB比較，CN敏感性略差，但因其終產物較局限，很少彌散，光鏡觀察較為適合。
（2）ALP，是以As-Mx為底物，FB/FR為發色團，生成藍色/紅色不溶性沉淀。ALP標記抗體主要用于內源性過氧化酶含量較高的血細胞、淋巴細胞等的ICC染色。顯色液內加入終濃度為2～4mmol/l 的levamisole, 大多數內源性ALP活性可被抑制。通常左旋咪唑（levamisole）以每毫升60～120mmol/L濃度的貯存液-20℃冰箱保存。應用時稀釋30倍。為避免反復稱取，試劑吸水，As-Mx、FR、FB試劑均應小量分裝后-20℃冰箱保存，左旋咪唑能抑制內源性堿性磷酸酶活性。例如：以每次所用顯色液30ml計算，分裝As-Mx 5～7mg/支、Fr 8mg./支、FB7mg/支，每次使用一支，用前稀釋30倍，過濾顯色 。FR、FB等在光照射條件下易引起沉淀，故顯色反應在暗處進行。
（3）GOD，是以葡萄糖為底物的酶，其顯色方法為β-D-葡萄糖67mg、NBT6.7mg、PMS（Phenazine Methylsulfate）0.167mg,0.05mol/L PB(pH8.3)10.0ml,37℃孵育1h。生成藍色不溶性沉淀。該終產物不溶于有機溶劑，切片可脫水透明，長期保存。但GOD的敏感度較HRP和ALP為低，電子供體少，應用較局限，主要用于兩種酶的放大技術，能提高方法和敏感性和特異性。即用GOD和HRP分別標記第二、第三抗體（例第一抗體為小鼠單克隆抗體、第二抗體為GOD標記的兔抗鼠IgG，第三抗體則為HRP標記的羊抗兔IgG），ICC染色，以葡萄糖-DAB作顯色劑。基本原理如（圖4-3）。在這里HRP是作為第二酶系統，利用葡萄糖氧化時生成的H2O2作底物，催化酶促反應，不受內源性過氧化酶的影響。而且GOD和HRP所標記的抗體是結合在同一抗原位置，所以能良好地顯示組織抗原的存在。其主要染色步驟為：
①切片經第一抗的孵育；②漂洗，GOD標記的第二抗體孵育40～60min（室溫）；③漂洗，HRP標記的第三抗體孵育30～45min（室溫）；④漂洗，顯色、脫水透明觀察同前。
圖4-3 兩步酶催化反應原理
二、非標記抗體酶法
由于酶標抗體存在一些缺點，例如①酶與抗體間的共價連結可損害部分抗體和酶的活性；②抗血清中的非特異性抗體被酶標記后，與組織成分結合，可致背景染色等。為此Sternberger等在酶標法的基礎上，發展了非標記抗體酶法。包括酶橋法（Enzyme Bridge Method）和過氧化物酶抗過氧化物酶法（Peroxidase Antiperoxidase Method, PAP法）。現分述如下。
（一）酶橋法
1．基本原理 首先用酶免疫動物，制備效價高、特異性強的抗酶抗體，然后使用第二抗體作橋，將抗酶抗體連結在與組織抗原結合的第一抗體上，再將酶結合在抗酶抗體，經呈色顯示抗原的分布。在此過程中，任何抗體均未被酶標記，酶是通過免疫學原理與抗酶抗體結合，避免了共價連結對抗體和酶活性的損害，提高方法的敏感性，且能節 省第一抗體的用量。
2．染色步驟 主要程序如圖4-4
圖4-4 酶橋法主要染色步驟
（1）切片準備及第一抗體孵育前處理同間接法，第一抗體（假設來自種屬A）孵育24h（4℃）。第一抗體的稀釋度可高些，使抗體的兩個Fab段均與組織抗原結合，較牢固，漂洗時不易丟失。
（2）切片與第二抗體（也稱橋抗體，抗種屬a IgG抗體）孵育1～1.5h（室溫）。應用過量的橋抗體能保證一個Fab段與第一抗體結合，另一個Fab段游離。
（3）切片與抗酶抗體（來自種屬A）孵育1～1.5h（室溫）。因抗酶抗體和第一抗體均系種屬a IgG，具有相同的抗原性 ，所以 橋抗體游離的Fab能與抗酶抗體結合，起到橋的作用，將抗酶抗體連結在與組織抗原結合的第一抗體上。
（4）切片與酶（HRp 70～100μg/ml,PBS溶解）孵育0.5h（室溫），酶與抗酶抗體結合。
（5）顯色等與酶標抗體法相同。
酶橋法克服了酶標抗體法的缺點，較好地保護了抗體和酶活性。但仍有其不足：①在酶抗體血清中，含有低親合力和高親合力兩類抗體，它們作為抗原與橋抗體結合，主要依賴于橋抗體對它的親合力，而與其本身對酶的親合力無關，故二者均可被連結在橋抗體上。低親合力的抗酶抗體與酶結合較弱，漂洗時易解離，使大部分酶（70%左右）丟失，降低了方法的敏感性。②第三步所用的抗酶抗體血清中，亦含有非特異性抗體，其抗原性與抗酶抗體相同，所以能與橋抗體結合，但不能與酶結合，影響組織抗原的顯示。為此70年代初，Sternberger(1970)又建立了PAP法，并加以改良，現為ICC研究中常用的方法之一。
（二）PAP法
1．PAP的制備及特征 PAP復合物是離體制備的HRP抗HRP復合物，它的制備方法較多，現簡介其中之一。
（1）制備抗HRP血清：健康雄性家兔（2.0kg以上），可先于足跖皮下注射滅活的卡介苗（共10mg），2周后重復1次，刺激機體免疫系統功能，1周后于背部脊柱兩旁皮內多點注射1.0ml乳劑[（福氏完全佐劑，含HRP3.3mg(RZ=3.0)];間隔2周第2次注射，背部注入含HRP3.3mg的不完全福氏佐劑1.0mg；再間隔2周，第3次注射，2mgHRP（溶于2ml生理鹽水中），分別于前后小腿皮下和背部肌肉內多點注射，1周后采靜脈血，檢查效價。再隔1周第4次加強注射（條件同第3次），一周后檢查抗體效價，瓊脂糖擴散法（HRP0.1mg/ml）為1：128以上時，頸動脈取血，制備血清低溫保存備用。
（2）制備PAP復合物：離體條件下，使兔抗HRP抗體與HRP形成可溶性復合物。在制備抗HRP血清時，HRP的純度要高（RZ≥3），而制備PAP復合物時，HRP的質量要求不高，甚至可用酶的粗制品。
【步驟】
①取10.50ml抗HRP血清，加7.60ml含7.6mgHRP（1.0mg/ml）的水溶液。
②混勻，室溫1h后，離心16000g 4℃15min。
③0.9% NaCl(冷鹽水)溶解沉淀，離心16000g 4℃15min，重復4次。