免疫熒光技術

實驗方法原理

直接法是以熒光素標記的抗體直接與標本內的抗原反應，形成抗原—熒光素標記抗體復合物。根據熒光的分布位置及強度，確定相應抗原的存在與否及其所在部位。

實驗材料 抗體

試劑、試劑盒 PBS伊文氏蘭

儀器、耗材 顯微鏡

實驗步驟

1. 標本經固定后，PBS洗滌3×3 分鐘；

2. 加熒光素標記的抗體，濕盒內37 ℃孵育50 分鐘；

3. PBS洗滌3×3 分鐘；

4. 0.1 %伊文氏蘭復染；

5. PBS洗3 次，蒸餾水洗2 次，每次3 分鐘，以除去NaCl結晶；

6. 緩沖甘油封片，鏡檢。

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注意事項

直接法比較簡單，特異性也較高，但每種熒光抗體只能檢測一種相應的抗原，應用范圍較窄，敏感性也較低。

對實驗結果的觀察、判斷與分析是影響實驗結果的重要環節，判斷結果的好與壞、真與假需注意以下幾點。

1.必須設立對照染色（陰性或陽性對照），沒有對照染色的結果是沒有說服力的。

2.正確判斷真陰性和假陽性。

(I)了解抗原表達是否在特定部位，如VP陽性出現在神經元胞漿，Fos標記細胞胞核，若陽性產物不在抗原所在部位，通常認為是假陽性（彩頁圖2-7)。

(2)對陰性結果，不能視為抗原不表達，應該參考他人的結果或進行相應的對照實驗，尋找原因，判斷是否為真陰性。

(3)在切片破損區域，出血壞死灶或刀痕等位置容易出現陽性表達，應鑒別分析。

(4)染色時間的掌控很關鍵，可以避免非特異著色或假陽性細胞。

3.所有免疫組化操作步驟均能影響其結果，判斷的關鍵在于以下幾點。

(l)組織切片完整，結構清晰，說明灌注取材、脫水、制片過程中沒有問題。

(2)切片著色鮮艷，說明抗體種屬之間配伍沒有錯誤，染色步驟正常。

(3)陽性與陰性結果部位明確，說明所用抗體的特異性強。

4.切片例數、陽性產物數量統計、分析應符合統計學要求。

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其他

染色步驟繁瑣，因此每一步都很關鍵。在實驗中常出現的問題及解決方法如下。

1進行免疫組織化學染色時，必須證明組織內顯示陽性產物確實是抗原與相應抗體特異性結合所產生的。避免假陰性或假陽性造成的困擾，要嚴格對照實驗才能對實驗結果做出正確評價。

2掉片是染色過程中常遇到的問題之一。解決方法：

① 使用經多聚賴氨酸或APES包被過載片，黏附效果最好，但價格相對昂貴；

② 也可用經1%明膠包被的載玻片貼片；

③ 貼有切片的載片從-20℃拿出時，可先在4℃放置30min,后再放于室溫充分晾干，避免切片因過快變熱而掉片；

④對石蠟切片進行抗原修復時，應避免修復液干涸，切片暴露在外，需等修復液徹底降溫后，再將切片拿出漂洗，禁忌驟熱驟冷引起切片收縮掉片。

3.關于抗體涉及以下幾個方面：

①種屬在進行雙重免疫標記時，要選擇來源于兩種不同種屬動物的一抗，如選擇來源于rabbit和mouse的抗體，二抗則用帶有不同熒光素標記的，如抗rabbit或抗mouse二抗， FITC和Tex-Red;

②孵育時間和溫度兩種一抗可以同時孵育，然后加入相對應的抗－抗的二抗進行孵育，一抗孵育時間室溫至少需要16h,二抗孵育室溫不宜超過4h,選擇4℃孵育比較好，背景比較清晰，另外孵育時夏天特別注意室溫溫度；

③抗體稀釋液通常第一抗體選擇1%牛血清白蛋白進行稀釋，第二抗體選擇用0.01mol/LPBS稀釋。

4.免疫組織化學染色中的非特異性的問題，是決定結果好壞的關鍵問題，其核心問題是交叉反應。選擇特異性強、親和力高、稀釋度高的第一抗體是避免非特異染色最有效的方法。實驗中常用到的抗體主要是單克隆抗體和多克隆抗體。單抗是針對單－抗原決定簇制備的抗體，具有特異性強、重復性好等優點，但在提純過程中易變性，穩定性差；多抗是將純化的抗原直接免疫動物后，從動物血中獲得的免疫血清，其可以識別多個抗原表位，因此特異性相對較低、易產生抗體的交叉反應、重復性差、每批次都有可能不同。在實際工作中，可根據具體需要以及參考文獻的報道選擇合適的抗體。其他原因及解決辦法如下。

(1)抗原間的交叉反應主要是標本固定不當或組織抗原封閉不全。每個抗原有不同的抗原決定簇，也可能有類似的抗原決定簇。因此可以選擇結構相近的抗原做抗體吸收實驗以避免抗原間的交叉反應。

(2)抗體與抗原除待檢測的抗原外，組織中還可能存在類屬抗原，也可與相應抗體結合。通常用2%-5%牛血清白蛋白或二抗來源的動物血清進行封閉。

(3)二抗第二抗體產生的非特異性主要是非IgG蛋白或非特異的IgG蛋白之間，通過特異性反應或通過非特異的疏水鍵與組織或細胞結合，產生非特異性染色。處理方法同上。

(4)熒光性非特異組織有自發熒光；部分游離熒光素殘留在二抗中，未與抗體蛋白質結合；抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶了過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現非特異性染色。解決辦法可以通過對照實驗或PBS代替進行鑒別和排除。注意選擇特異性強、質量好、純度高的熒光二抗。

(5)內源性過氧化物酶若標本因灌流固定不當，可能存在紅細胞和粒細胞中的內源性過氧化物酶。可以通過甲醇-H202處理切片，避免DAB反應形成非特異染色。

5.片子著色不均勻現象，主要是：

①石蠟切片染色，脫蠟不充分，可以先在60℃烤箱烤1h;

②脫水不徹底，需配置新鮮的梯度酒精；

③貼片孵育抗體時抗體覆蓋不均勻，切片傾斜，抗體流失等原因，需平放切片，切片擦干后再加抗體，也可以用免疫組化筆（在載玻片上的有組織的邊緣畫圓，防止抗體外溢），既節約抗體又避免抗體流失；

④冰凍切片漂染，每組切片不宜太多，否則互相重疊，導致接觸抗體不均勻。

6.切片染色背景太深，不易區分特異性與非特異性著色。這主要是：

①抗體孵育時間過長或抗體濃度過高；

②抗體質量差或變質；

③DAB濃度過高，顯色時間過長，或反應時溫度過高；

④ PBS沖洗不充分，殘留抗體增強著色；

⑤ 切片染色過程中出現干片，而導致非特異性著色增強；

⑥切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太久（大于24h),不可室溫長時間放置。

7.石蠟切片抗原修復方法很多，從弱到強有胰酶修復、微波修復、高壓修復。修復液也分若干種，如pH6.0袧橡酸鈉修復液、pH8.0的乙二氨四乙酸二鈉(EDTA)修復液、pH9.0的EDTA-Tris修復液等，修復時間也根據標本、抗原、抗體等選擇。

8.各個步驟之間的漂洗非常重要，可以防止一抗、二抗殘留試劑引起的非特異著色。如果染色抗體種類較多，切片組別較多時不僅漂洗時間要足夠，而且還可以單獨漂洗，防止抗體之間的交叉污染。