SP(streptavidin-perosidase)法,即鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法。
按標記物質的種類,如熒光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等,可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標法和免疫金銀法等。按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步、三步或多步法);按結合方式可分為抗原-抗體結合,如過氧化物酶-抗過氧化物酶(PAP)法和親和連接,如卵白素-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(SP)法等,其中SP法是最常使用的方法。
一般的sp法步驟啊,具體如下:
1、烤片,68℃,20分鐘,
2、常規二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水;二甲苯I20min?二甲苯II20min?100%酒精10min?100%酒精10min?95%酒精5min?80%酒精5min?70%酒精5min
3、阻斷滅活內源性過氧化物酶:3%H2O237℃孵育10min,PBS沖洗3X5min;
4、抗原修復:置0.01M枸櫞酸緩沖液(PH6.0)中用煮沸(95℃,15-20min),自然冷卻20min以上,再用冷水沖洗缸子,加快冷卻至室溫,PBS沖洗3X5min。
5、正常羊血清工作液封閉,37℃10min,傾去勿洗。
6、滴加一抗4℃冰箱孵育過夜,PBS沖洗3X5min(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照);
滴加生物素標記二抗,37℃孵育30min,PBS沖洗3X5min;
7、滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液,37℃孵育30min,PBS沖洗3X5min;
8、DAB/H2O2反應染色,自來水充分沖洗后,
蘇木素復染,常規脫水,透明,干燥,封片。