免疫多聚酶鏈反應

實驗概要

免疫多聚酶鏈反應(PCR)是一種抗原檢測系統，將一段已知序列的DNA片段標記到抗原抗體復合物上，再用PCR方法將這段DNA擴增，然后用常規方法檢測PCR產物。由于PCR具有強大的擴增能力，因而比常規的免疫學檢測法，如ELISA和放射免疫測定(RIA)的敏感性提高好幾個數量級。

實驗原理

免疫PCR的原理與ELISA和RIA等常規免疫學檢測方法基本相同，只不過是用DNA片段代替了酶或放射性核素作為標記物。通常需要一個對抗體和DNA具有雙親和力的連接物，將DNA與抗體偶聯在一起。抗體與抗原結合后，用該DNA片段特異的一對引物做PCR，分析擴增產物。特異性PCR產物的存在表明有該DNA片段標記的抗體所針對的特異性抗原存在。

將DNA標記到抗體分子上的方法有多種，一種是通過鏈親和素(streptavidin)蛋白A(protein A)的融合蛋白，它具有兩種獨立的結合功能，鏈親和素結合生物素(biotin)，蛋白A結合免疫球蛋白G的Fc片段，從而使生物素標記的DNA片段連接到IgG分子上。另一種方法是用單特異性的多價結合分子，如親和素(avidin)或鏈親和素，它們是四價分子，即一個分子可與四個生物素分子結合，因而可以將生物素標記的DNA片段與生物素標記的抗體分子結合到一起。

主要設備

免疫PCR可以在96孔塑料板(ELISA板)或微量離心管(0.5ml)中進行。

實驗步驟

1. 生物素標記特異性抗體免疫球蛋白(如IgM、IgG)的Fc片段上有糖基存在，因而可用能與糖基結合的BiotinLChydrazide作生物素標記。

   1) 將純化的抗體(IgM或IgG，0.1-1mg/ml)在標記緩沖液(0.1mol/L NaAc,pH值5.5，0.1mol/L NaCl)中4℃透析過夜。

   2) 吸取0.5ml至微量離心管中，加過碘酸鈉溶液至終濃度10mmol/L，置冰浴上于暗處孵育30min，使抗體分子上的糖基氧化。

   3) 將氧化的抗體過PBS平衡的Sephadex G25 PD10預裝柱(Pharmacia)，使之與過碘酸鈉分開。收集蛋白峰。

   4) 向抗體管中加入biotinLChydrazide(Pierce)至終濃度5mmol/L，置混搖器上室溫孵育1h。

   5) 用含0.02% NaN_３的PBS平衡Sephadex G25預裝柱，將生物素標記的抗體分子過柱與游離的生物素分開。收集蛋白峰，保存在-20℃。

2. 生物素標記DNA片段作為將與抗體偶聯的報告DNA片段，應確保在待測抗原來源的機體DNA中無同源序列，如可選用大腸桿菌的序列作為報告DNA去檢測人源的標本。DNA片段大小為300-500bp，生物素標記可采用PCR方法，根據報告DNA的核苷酸序列合成一對引物，其中一個引物的5′端堿基上帶有生物素標記。

   1) 在0.5ml PCR管中將下列試劑混合：

試劑添加量終濃度10×PCR緩沖液10μl1×25mmol/L 4dNTP混合物8μl 0.2mmol/L

50μmol/L生物素標記的上游引物1μl 0.5μmol/L

50μmol/L下游引物1μl 0.5μmol/L

15mmol/L MgCl_２1μl 15mmol/L模板DNA1μl<1μgTaqDNA聚合酶1μl5U加H_２O至100μl

   2) 混勻后上面覆蓋液體石蠟。

   3) 95℃加熱5min，然后在PCR儀上按下列程序擴增：94℃ 1min；55℃ 1min；72℃ 1min；40個循環。最后72℃延伸10min。

   4) 加等量酚氯仿抽提，然后加10μl 3mol/L KAc,250μl無水乙醇，置-70℃ 30min。

   5) 離心沉淀DNA片段，用70%乙醇洗一次。

   6) 將沉淀干燥后重溶于TE緩沖液，保存在-20℃。

3. 制備抗體親和素DNA復合物將生物素標記的抗體與親和素按等分子濃度混合于含有1mg/ml BSA的PBS中，室溫孵育30min，再加入兩倍分子濃度的生物素標記的DNA片段，繼續孵育30min，最后加入10倍分子濃度的生物素，將親和素分子上的結合部位飽和。最后過凝膠過濾柱將復合物與未結合的單體分開，加BSA達1mg/ml，分裝后凍存于-20℃。

4. 免疫PCR

   1) 按常規ELISA方法，用包被緩沖液稀釋抗原，加到96孔塑料板或0.5ml PCR管中，4℃過夜。

   2) 用PBS洗三次，然后每孔加200μl封閉液(PBS含10mg/ml BSA,1mg/ml魚精DNA)，室溫孵育3min。

   3) 用TETBS(其配方：20mmol/L TrisHCl pH值7.4，0.15mol/L NaCl,01% Tween 20, 0.1mmol/L EDTA,0.02% NaN_３)洗三次。

   4) 將抗體親和素DNA復合物稀釋于含有1mg/ml BSA和0.1mg/ml魚精DNA的TETBS中，每孔加50μl，室溫孵育1h。

   5) 用TETBS洗5次，然后將塑料板或管倒置在吸水紙上拍打以控干水分。

   6) 每管中加50μl PCR反應液，含有下列成分：

試劑添加量終濃度

10×PCR緩沖液5μl1×

2.5mmol/L4dNTP混合物4μl 0.2mmol/L

50μmol/L上游引物0.5μl 0.5μmol/L

50μmol/L下游引物0.5μl 0.5μmol/L

15mmol/LMgCl_２5μl 1.5mmol/LTaqDNA聚合酶0.5μl2.5U加H_２O至50μl

   7) 混勻后，上面覆蓋液體石蠟。

   8) 95℃加熱5min，然后在PCR儀上按下列程序擴增35個循環：94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min。最后72℃延伸10min。

   9) 每管取5μl作瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色后觀察結果，如在PCR時加入了放射性核素標記，則可用X光片顯影。

亦可在凝膠電泳后做southernblot，用特異性探針雜交，進一步提高其特異性和敏感性。

注意事項

本實驗的關鍵步驟是獲得適當的抗體DNA復合物。用鏈親和素將生物素標記的抗體與生物素標記的DNA偶聯的方法，因每個鏈親和素分子可與四個生物素分子結合，因此要優化反應條件，以使得每個鏈親和素分子既能結合上抗體分子，又能結合上DNA片段。

此外還可用化學方法將DNA片段與抗體分子共價偶聯，即將抗體分子和5′端氨基修飾的DNA片段分別用不同的雙功能偶聯劑激活，然后通過自發的反應偶聯到一起，比如，用NSuccinimidylSacetyl thioacetate(SATA)活化氨基修飾的DNA片段，用SulfoSuccinimidyl 4(maleimidomethyl) Cyclohexane1Carboxylate(SulfoSMCC)修飾抗體分子，然后將二者在一小管中混合，通過加入鹽酸胲(Hydroxylamine hydrochloride)使二者偶聯在一起。免疫PCR具有高度敏感性。因此，抗體和標記DNA的任何非特異性結合均會導致嚴重的本底問題。因而在加入抗體和標記DNA后必須盡可能徹底地清洗。即使有些特異性結合的抗體或標記DNA被洗掉了，亦可在最后通過增加PCR的循環次數得到彌補。此外，應用有效的封閉劑對防止非特異性結合也是非常重要的。可用脫脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封閉劑，用魚精DNA做核酸封閉劑。防止本底信號的另一個重要因素是控制污染，這也是所有敏感的檢測系統存在的問題。即使每一步試驗都做得非常認真，重復使用同樣的引物和標記DNA均會產生假陽性信號。免疫PCR的一個主要優點是標記DNA序列完全是人為選定。因此標記DNA及其引物可經常變換，以避免由于污染造成的假陽性信號。

免疫PCR可以檢測到常規免疫學方法無法檢測的樣品。因此，應用免疫PCR可在微觀水平(單細胞)檢測到抗原，定量PCR產物可以估計某一標本中的抗原數量，在臨床診斷中可在疾病早期抗原量很低時檢測到微量的抗原。