免疫復合物的檢測

發布時間：2019-08-13 09:21 原文鏈接：免疫復合物的檢測

免疫復合物在體內存在有兩種方式，一是存在于血液中的循環免疫復合物（CIC），一是組織中固定的免疫復合物。免疫復合物的檢測技術可分為抗原特異性方法和非抗原特異性方法。在大多數情況下，免疫復合物中的抗原性質不太清楚或非常復雜，所以抗原特異性方法并不常用。

一、循環免疫復合物的檢測

根據免疫復合物的物理學、免疫學和生物學特性，已經設計出很多檢測CIC的方法（表1）。

表1 循環免疫復合物的常用檢測方法

類別	原理	方法	敏感性	備注
物理法	分子大小	1、超速離心	——	適于研究
2、分子超濾	——	適于研究
3、凝膠過濾	30μg	適于研究
溶解度	1、PEG沉淀	20μg	粗定量，易推廣
2、冷沉淀	——	定性，臨床應用
補體法	固定補體，結合C1q	抗補體試驗	0.1μg	常用，特異性差
1、C1q凝膠沉淀試驗	100μg	定性，不易普及
2、C1q偏離試驗	4μg	不易普及
3、液相法	10μg	不易普及
4、固相法	1μg	不易普及
膠固素	膠固素結合試驗	3μg	敏感，穩定
抗Ig法	結合RF	1、RF凝膠沉淀試驗	100G	定性，不敏感
2、mRF固相抑制試驗	1～20μg	不易普及
3、PRF凝集抑制試驗	1～10μg	不易普及
結合Ig	抗抗體法	2～3μg	不易普及
細胞法	Fc受體	1、血小板凝集試驗	1～4μg	需新鮮制備
2、ADCC抑制試驗	5～10μg	細胞活性質控難
3、Mφ吞噬抑制試驗	0.03μg	細胞活性質控難
補體受體	1、Raji細胞法	6μg	需維持細胞株
2、花環抑制試驗	10μg	影響因素多

（一）物理測定法

1、聚乙二醇法聚乙二醇（PEG）是乙二醇聚合而成的無電荷形多糖分子，分子量變化范圍較大，常用的分子量是6000。用3％～4％濃度的PEG可以選擇性地將大分子免疫復合物沉淀下來，其作用機制尚不甚清楚。將PEG溶液與待檢血清混合，置4℃冰箱過夜后離心，將沉淀物用PEG溶液充分洗滌，重新溶解于0.01mol/L的NaOH中，在波長280nm下測量溶液的吸光度；也可利用散射比濁法直接測定PEG沉淀的免疫復合物；以不同濃度的熱聚合IgG作為參考標準來計算CIC的含量。聚乙二醇法簡單易行，可在臨床工作中推廣。但此法易受多種大分子蛋白和溫度的干擾，特異性稍差。PEG法還特別適用于沉淀獲得CIC，再進行解離分析其中的抗原與抗體。

2、冷球蛋白測定在某些病理情況下，血清中的免疫復合物具有可逆性冷沉淀的特性，于4℃冰箱中放置1～3天可自發地沉淀下來；此種情況多見于冷球蛋白血癥，所涉及的抗原包括自身的IgG、IgM、核苷酸、腫瘤相關抗原、腎小管上皮、甲狀腺球蛋白、紅細胞基質等，還有外源性抗原如乙肝病毒、EB病毒、巨細胞病毒、牛白蛋白和馬蛋白等。

（二）補體相關測定法

IgG和IgM類抗體與抗原結合后，重鏈CH2區的補體結合點暴露，可以固定C1q并激活補體的系列反應，這是利用補體有關技術檢測免疫復合物的基礎。

1、C1q結合試驗將待檢血清先行加熱56℃30min，以滅活其中的補體和破壞已與CIC結合的C1q，空出補體結合點。CIC與C1q的結合可用多種方法進行檢測，常用的有以下3種。

（1）液相法先將同位素標記的C1q與滅活過的血清標本混合作用，再加入0.5%（終濃度）的PEG將結合了C1q的CIC沉淀下來，通過檢測沉淀物中的放射活性來計算CIC的含量。

（2）固相法先將C1q吸附于固相載體表面，加入待檢血清使CIC與C1q結合，再加入同位標記的或酶標記的抗人IgG或SPA，最后檢測其放射活性或酶活性。

（3）C1q偏離試驗先將同位素標記的C1q與滅活的血清標本混合，再加抗體致敏的綿羊紅細胞，溫育后離心，檢測紅細胞上的放射活性。紅細胞的放射活性與免疫復合物的量呈負相關。

2、補體試驗本法的原理類似補體結合試驗。將一定量的補體（多為混合豚鼠血清）與滅活的待檢血清混合溫育，反應后加入致敏綿羊紅細胞。如出現溶血表示血清中沒有CIC存在；不溶血說明標本中有CIC存在。將血清標本做不同稀釋，并與已知的熱聚合IgG作對照，可以計算出CIC的含量。本方法的靈敏度較高，且易于在一般實驗室開展，不足之處是特異性較差。

3、膠固素結合試驗膠固素（conglutinin）是牛血清中的一種正常蛋白，能與C3d特異性結合；體內與補體結合的CIC都帶有C3d，因此膠固素可與CIC結合。用一定量的膠固素包被塑料管，往管中加入稀釋的血清標本，溫育后再加入同位素標記或酶標記的抗人IgG抗體，最后檢測各管的放射活性或酶活性，計算CIC的含量。膠固素性質穩定、容易保存、來源方便、價格便宜，檢測方法也不復雜，便于推廣。本法的不足是只能檢出已結合補體的CIC，但不論何種激活途徑都一樣檢出，并可用作CIC分離。

（三）抗球蛋白測定法

類風濕因子（RF）為抗IgG的自身抗體，與變性IgG、熱聚合IgG和IC都有較強的親和力。單克隆RF（mRF）可從待發性冷球蛋白血癥的血清中提取，多克隆RF（pRF）可從類風濕性關節炎的血清中提取。用mRF比pRF的敏感性更高一些。

1、mRF固相抑制試驗將mRF吸附于固相載體上，隨后加入血清標本，再加入同位素標記的可溶性熱聚合IgG。如果標本中含有IC，固相mRF已與IC結合，熱聚合IgG與mRF的結合使被抑制，所以固相中的放射活性與CIC的含量呈負相關。也可用同位素標記的mRF先與血清標本反應，再加入熱聚合IgG附著的瓊脂糖珠，溫育并離心洗滌后測量沉淀物的放射強度，測定值與CIC的含量呈負相關。此法的敏感性比前法更高一些。

2、pRF膠乳凝集抑制試驗將pRF與血清標本混合，再加入IgG致敏的膠乳懸液。如果標本中有CIC存在，則pRF先與之結合，凝集反應呈陰性。

3、抗抗體法抗抗體可存在于極個別的健康人血清中，是一種抗IgG F（ab＇）2的IgM類抗體，能與已結合抗原的IgG反應，但不與游離的IgG或熱聚合IgG反應，因而特異性較高。先將抗抗體與待檢血清混合，再加入IgG致敏的人O型Rh+紅細胞；如標本中有CIC存在，抗抗體被中和，致敏紅細胞不出現凝集。

以上各種抗球蛋白試驗以mRF法敏感性最高，但是mRF較難尋找。這類方法易受內源性RF的干擾，最好先行檢查并除去標本中的內源性RF后再行試驗。若遇標本中有聚合Ig，RF法也易出現假陰性；改用抗抗體法可避免這種現象，但是抗抗體的來源困難。