試劑、試劑盒 免疫親和介質溴化氰（CNBr) 活化的 Sepharose 4BHCl55% 飽和 AMS 沉淀物偶聯緩沖液乙醇胺緩沖液 BLAC 洗脫緩沖液二硫蘇糖醇硫氰酸鉀疊氮鈉
儀器、耗材 Econo-柱SDS-PAGE 電泳裝置
實驗步驟
材料與設備
免疫親和介質（帶固定化的 MAb NT73; 見下文)
溴化氰（CNBr) 活化的 Sepharose 4B(Sigma Chemical Co.C 9142)
HCl(1 mmol/L)
55% 飽和 AMS 沉淀物（見 p.154)
Econo-柱 (Bio-Rad Laboratories)
SDS-PAGE 電泳裝置
試劑
偶聯緩沖液
乙醇胺（1mol/L)
緩沖液 B
LAC 洗脫緩沖液
二硫蘇糖醇（DTT)(0.1mol/L)
硫氰酸鉀（KSCN)(2mol/L)
疊氮鈉（2%)
(配方，見「試劑的配制 pp.l84~189)
操作程序
免疫親和介質的制備和保存
本操作所用的產 MAb 的小鼠雜交瘤是按標準方法（見 Harlow 和 Lane,1988) 制備的。MAb 是用 45% 飽和 AMS 沉淀，并利用它們在 pH7.0、25 mmol/L NaCl 條件下不能與 DEAE-纖維柱結合的性質，從小鼠腹水純化得到的。在上述條件下，許多小鼠 IgG MAb 可經 DEAE 柱流出，所得 MAb 制備物的純度大于 80%, 已適于作免疫親和層析（許多純化 MAb 用的方法，可參見 Harlow 和 Lane,1988)。MAb 可共價偶聯于經溴化氰（CNBr) 活化的 Sepharwse 上，所用方法概述如下，亦可參見 Pharmacia 出版物 Affinity Chromatography:Principles and Methods (Pharmacia LKB Biotechnology,1993)。
1) 取 1 gCNBr 活化的 Sepharose4B 膠（體積約 3.5 ml) 浸泡于 1 mmol/LHCl 溶脹并洗滌。
2) 將溶于偶聯緩沖液的約 10 mg MAb 與洗滌過的 Sepharose 4B 膠在室溫下混合 2 h。
3) 室溫下將 Sepharose 4B 膠置 1md/L 乙醇胺中 2 h, 封閉膠上殘存的活性基團。
4) 洗去多余的蛋白質和封閉劑。在正常情況下，每毫升裝柱的免疫親和介質含 2~3 mg 共價偶聯的 MAb。免疫親和介質 4°C 保存于含 0.02% 疊氮鈉的緩沖液中，以防細菌生長。
免疫親和層析
在本實驗中，用免疫親和柱結合核心 RNA 聚合酶和各種結合的σ因子。由于σ32 在出發細胞中是過量生產的，因此大多數核心 RNA 聚合酶都含有結合的σ32（在正常情況下，σ32 可能只是 RNA 聚合酶的次要成分)。核心 RNA 聚合酶-σ32 復合物呈酸性，可用
PEI 進行沉淀。
1) 使用前取 2 ml 免疫親和介質漿狀物重懸于 10 ml 緩沖液 B 中洗滌。室溫下 1000r/min 離心 1~2 min。離心操作必須輕緩，因為在高速下離心力會把膠壓碎。重復此步操作一次。這樣洗兩次可除去疊氮鈉和在儲存時從膠上瀝出的 MAb。
2) 將 55% 飽和 AMS 沉淀物溶于 20 ml 緩沖液 B 中，室溫下 13000r/min 離心 10 min, 去除所有不溶物（如有沉淀，其量亦應極少)。留上清，取樣（樣品 I)。
3) 將溶解的澄清的 AMS 沉淀液加于沉淀的 Sepharose 4B 膠中，室溫下緩緩搖動混合 30 min。
方案補充實驗：于 0、5、15 和 30 min 時各取樣品 100ul。各樣品立即離心，并取上清作 SDS-PAGE 分析，以確定蛋白質與免疫親和介質結合需要多長時間（見 p.178)。
注：與免疫親和介質接觸的必須是只含低濃度還原劑（DTT) 的緩沖液，否則，免疫球蛋白 G(IgG) 的二硫鍵會被還原，從而導致 IgG 重鏈和輕鏈從介質上脫落。為此，我們用緩沖液 B(不含 DTT)。RNA 聚合酶在不含 DTT 的緩沖液中雖能短暫存活，但應盡快將 DTT 回加于柱層析組分中。這很容易做到，于每個空的組分管中預置 lul 0.1mol/L DTT 即可。去掉緩沖液 B 中 5% 的甘油；如有甘油存在，洗柱時，有些酶會因此步操作中所用 MAb 的多元醇應答性而從柱上洗脫下來。
4) 緩緩離心，離下層析介質，棄上清（IAC 穿過液)，將介質重懸于 10 ml 緩沖液 B 中，再注入 Bio-Rad Econo 柱中。
5) 收集 10 ml 穿過液（第 1 次洗柱)，加 5 ml 以上緩沖液 B, 再收集 5 ml 穿過液 (第 2 次洗柱)。
注：洗滌介質和從介質上洗脫σ因子可在試管中以分批方式進行試驗，加人合適的緩沖液，緩緩地混合 15~30 min, 再將介質緩緩離心下來。盡管在分批方式中能較有效地使 a32 因子結合于介質及去除未結合的物質，但隨后的洗滌和洗脫仍在一根柱上進行。當介質置于洗脫緩沖液中時，σ32 就會從抗體上解離下來，但必須以三維無規行走 (three-dimensinal random walk) 的方式從 100um 大的 Sepharose 微珠中擴散出來，這需要很長時間。而σ32—旦「走」出微珠，就會較有效地從微珠上洗脫下來，如果緩沖液在柱式 (column mode) 層析中是從旁流過的話。
6) 在室溫下，每次給柱加 lmlIAC 洗脫緩沖液，共 10 次，分別收集各組分于含 lul 0.1mol/L DTT 的 Eppendorf 管中。將各組分（1~10 管) 放置于冰上，用快速蛋白質斑點印跡（Westerndotblot) 或 SDS 凝膠電泳分析測定，以確定哪幾管組分可以合并。
注：IAC 洗脫緩沖液的密度大于緩沖液 B 中的免疫親和介質。加入時可能會損壞柱子介質上浮！）。因此，必須在洗柱結束時讓柱介質頂部略向下壓緊，再極緩謾地加人第一次 1-ml 洗脫緩沖液（最好先加 200ul, 待其下沉后，再慢慢加入其余部分)。如加粘的洗脫緩沖液時柱的流速變慢，則可在柱的底部接一根 6~10 cm 長的塑料管，以增加靜水壓，促使緩沖液流過柱子。
7) 柱子使用后，用 2mol/LKSCN(—種強的離液序列高的變性鹽，它不會使抗體不可逆失活處理柱子，以去除殘留的非共價結合的蛋白質。再用緩沖液 B 洗柱，并將其 4°C 保存于含 0.02% 疊氮鈉的緩沖液 B 中。如柱子得到細心的清洗和保存，則可反復使用幾十次。
POROS 50 Q 陰離子交換層析（可選用）
欲獲得純度更高的核心 RNA 聚合酶-σ32 復合物，可用 50 mmol/L Tris(PH7.9) 將 IAC 柱的峰組分稀釋 10 倍，把丙二醇降至 3%,NaCl 濃度降至 0.075mol/L。經稀釋的樣品還可進行離子交換層析, 方法如 PP.149~151 所述，除用 POROS 50Q 柱代替 FOROS 50S 柱者外。最后合并的組分對儲存緩沖液（緩沖液 A+50% 甘油）進行透析。如 P.151 所述。