光譜FCM工作原理

　　一，全光譜流式細胞儀的技術特點（以SP6800為例）：

　　1， 用棱鏡分散發射光

　　2， 通過32個PMT從每個細胞獲得每個染料不同波段的發射光信號

　　3， 具有高速，高靈敏度，準確，自動和實時的算法。

　　4， 具有較寬的光譜檢測范圍和高光譜分辨率，并可區分光譜相近的FP和熒光素如FITC（Em 519 nm）和EGFP（Em 507nm）。

　　5， 可以測量和減去每個細胞的自發熒光，提高的信噪比和改善弱表達指標的分辨率。

　　二，儀器的設計和關鍵部件

　　光譜FCM的光學示意圖如圖1a所示。SP6800配備488/638 nm激光器，流動池芯片，光電二極管（PD），象限PD，10個連續棱鏡，微透鏡陣列和32通道線性陣列PMT（32ch PMT）。 此光譜FCM捕獲500 nm至800 nm多個波段熒光信號，連成光譜信息。

圖1.光譜FCM的設計

　　a）獨特光學設計：488/638 nm非共線，流動池芯片，非晶硅PD，象限PD，棱鏡，微透鏡陣列和32ch PMT。

　　b）32ch PMT中每個通道對應的波長位置。獨特的棱鏡光學器件實現在藍綠色區域的通道比紅色區域更密，以增加該區域中的波長分辨率。

　　c）流動池芯片：藍色，綠色和粉色箭頭分別標記鞘液，樣品和廢液流。紅色圓圈標記由石英制成的檢測區域。

　　d）檢測Ultra Rainbow 8峰微球獲得的光譜圖。通過488nm激光激發（左）和638nm（右）分別顯示獲得的光譜。橫坐標是500nm至800nm的波長，縱坐標是熒光強度。圖表中的顏色表示每個通道對應強度的微球密度。紅色表示高密度，綠色表示中，藍色表示低。 左圖32ch PMT中的第20-23個通道被屏蔽，以防止638nm激光照射到PMT中。圖中的黃色箭頭表示當光譜FCM以雙激光模式運行時使用熒光數據的波長區域。

　　e）截取PE信號波長區域中的Ultra Rainbow 8峰微球獲得的數據的直方圖（圖1d；左，橙色虛線波長范圍）。根據該數據可計算儀器的靈敏度MESF和線性。 54.0和527.8分別顯示來自最低強度微球（淺藍色）和第二低強度微球（紅色，緊鄰淺藍色）的平均熒光強度。

　　1，光學系統：

　　1.1， 光源

　　激發光光束功率分布通過聚焦透鏡形成垂直于流動方向的平頂曲線，在峰值強度的80%處，寬度為40 um；沿流動方向的光束分布為高斯，1/e2處為6 um。488/638nm激光點在空間上分離，流動池芯片表面的激光功率分別為40mW和60mW，能夠分別自動監控。平頂光束確保細胞左右位置些微變化時，CV依然較好。

　　1.2，光收集系統

　　十個連續的棱鏡是高度透明的，涂有反射膜；之后是一個定制的微透鏡陣列組件將每個光帶聚焦到PMT陣列的特定通道上，從而避免熒光光子丟失到邊界遮罩上；32ch PMT檢測500-800nm的光。此光學系統的設計在大多數FPs和熒光染料集中的藍綠色區域分配更多的通道實現高分辨率（圖1b）。當此光譜FCM以雙激光模式（488nm和638nm）運行時，32ch PMT中的第20至23個通道（617-662nm）將自動屏蔽，通過插入掩模防止638nm激光照射到PMT中。對于每個單細胞，488nm激發獲得28個通道（1–19和24–32）的熒光數據，638nm激發獲得9個通道（24–32），共獲得37個熒光通道數據（圖1d）。另一方面，在單激光模式（488nm激發）下運行時，采集32個通道的熒光數據。這種光譜數據收集允許在傳統的FCM處理速率下輕松分離相近的熒光光譜而實現多色分析。32ch PMT的增益可以為每個通道單獨控制，也可以控制整個32ch陣列的總電壓。

　　通過原始物鏡收集的散射光被分束器分割，再被原始分帶鏡進一步分割，這意味著低數值孔徑（NA）分量被反射為前向散射（FSC）信號，高數值孔徑（NA）分量被傳送為側向散射（SSC）信號。用非晶態硅PD檢測FSC和SSC，用FSC信號可檢測0.5 um到40 um的細胞尺寸。

　　第一反射散射信號用于使用散光聚焦算法控制Z焦點位置，以及使用象限PD跟蹤算法控制液流的中心位置（圖1a，橙色虛線），這種技術通常用于光盤伺服系統如CD和DVD。據此也可以確定細胞離開中心樣本流的對應X和Y的坐標。因此可以自動調整細胞和激光的正交。

　　2，液流系統

　　光譜FCM采用了可更換的流動池芯片，而不是傳統的石英流動室，它由塑料板和石英光學檢測組件組成，以減少更換流動池芯片時的儀器停機時間（圖1c）。流動池芯片的尺寸為75 mmX25 mmX2 mm，包含微流體通道，在基面上具有多個通道。有兩種類型的入口，一種用于測定的樣品，另一種用于鞘液，后者分為兩路，通過三維流體動力聚焦用兩側鞘液流將樣本流束縛于液流的中心。典型的樣本流直徑約為10 um，可通過單獨改變樣品壓力和鞘液壓力來控制樣本流直徑。

　　光學探測區域由石英制成，以最大限度地減少自發熒光，并高效傳遞光源488nm和638nm能量到達細胞上。更換式流動池芯片的優點是避免細胞和蛋白吸附的影響，保持檢測區域表面的清潔。光譜FCM采用自動芯片對準機制，通過校準微球SSC信號強度和變化來檢測和選擇每個芯片的最佳位置，并提示何時需要更換流動池芯片，以防檢測區域表面上的殘留物造成不良堵塞或性能下降。

　　出廠時有三個鞘液流速低、中、高，分別約為3 m/s、5 m/s和10 m/s流速，樣品流速分別約為18 ul/min、30 ul/min和60 ul/min。本文的所有數據均以中速采集。樣本事件率約是每秒10000個（eps）。

　　3，電子系統

　　對于信號處理，在50MHz采樣頻率下，脈沖數據分辨率為信號高度20位和信號面積32位。通過額外的信號處理，光譜FCM不僅提供完整的光譜信息，還提供解析后的傳統流式細胞術數據，展示成直方圖、雙參數散點圖，并可以實時顯示采樣信號變化情況。獲取的數據可以以FCS3.0和3.1的形式導出，進行或不進行光譜解混。

　　4，數據分析---光譜解混算法

　　光譜FCM根據最小二乘法（LSM），利用獨特的算法自動分析獲得的全光譜數據，從而實現重疊熒光光譜的分離（圖2a）。我們的算法的基礎如下: 從單個染色樣品和未染色樣品中得到的每個光譜都被認為是基本參考光譜。然后，利用每個染色和未染色參考光譜的分量，對多染色樣品進行數學擬合和解混。數學上估計的系數值反映了多染色樣品組成中每個光譜的貢獻大小。然后，我們可以同時估計每個細胞中每種熒光素的熒光強度，而不需要任何復雜的常規補償。

　　mi表示K通道的基礎光譜值；y=（y1，…，yK）T表示K個通道的觀測譜，其中T表示轉換系數，ωi 倍增因子，e 噪聲，M 熒光染料的數目，然后事件數據被表示為方程。

　　 當只有一個熒光染料或熒光蛋白通過檢測時，基譜mi在某種程度上與標準化光譜的事件數據相同。實際上，熒光光譜通常是通過統計處理從單染樣品的多個事件數據的平均值計算出來的。另一方面，如果給出事件數據y和基譜mi，則ωi 倍增因子在數學上被估計。ωi 倍增因子被稱為熒光強度，是FCM中最重要的數字，因為用戶經常通過觀察ωi的分布來判斷樣本信息。LSM是確定ωi的一種常用方法，它可以通過公式獲得(33)。公式表達為：

　　因此，LSM僅通過最小化殘余信號來估計所有熒光染料的貢獻，并且僅根據參考光譜對每個檢測通道施加相等系數的假設來計算熒光強度。

　　然而，眾所周知，FCM數據具有異方差性，這是基于強信號通道中的較大噪聲和弱信號通道中的較小噪聲。為了給每個檢測通道施加適當的權重，我們開發了加權最小平方法（WLSM），其中λk是在通道K的權重：

　　其中diag（k）是對角矩陣，在對角分量中具有λ=（λ1，…λk）T。我們還設置了一個偏移量，以避免在熒光信號變暗時使λk過大或為負值。

　　圖2. 計算機模擬“光譜分離”和“熒光解離”的原理。

　　a） 光譜FCM解混算法利用所有標記的熒光素的基譜來分離得到其不同的貢獻（上圖）。另一方面，傳統的補償只利用窄波段的光來扣除重疊的熒光發射（下圖）。

　　b） 488同時激發FITC和PE形成的光譜圖（上圖）。光譜解混前模擬數據熒光圖（下圖）。為了幫助識別每一個種群，有些群被標識了不同的顏色。

　　c） FITC/PE, APC/APC-Cy7, PerCP/PerCP-Cy5.5, 和 AcGFP/FITC組合的光譜（上圖）。每個熒光的歸一化強度譜顯示為縱坐標。由于這些模擬數據是在雙激光模式下產生的，因此將20到23之間的PMT通道的強度值指定為零。分別應用LSM和WLSM算法后，FITC/PE, APC/APCCy7, PerCP/PerCP-Cy5.5, 和 AcGFP/FITC組合的熒光圖（下圖）。為了幫助識別點圖中的每個群體，有些群體被標識上不同的顏色。

　　d） 應用LSM和WLSM后，兩種熒光染料的熒光強度比變化下的相對染色指數比較：FITC/PE, APC/APC-Cy7, PerCP/PerCP-Cy5.5, 和 AcGFP/FITC。熒光比是以第二熒光染料除以第一熒光染料作為橫坐標，以相對染色指數作為縱坐標。

　　5，計算機模擬

　　在計算機模擬中，基礎數據集是由未染色和單染樣本數據合成而成的。使用熒光微球(BD FACS 7-Color Setup Beads, BD Biosciences, CA)或綠色熒光蛋白(GFP)結合微球(AcGFP (34,35), Clontech Laboratories Inc.）,獲取未染和單染數據。綜合方程如下，我們定義s[k]為事件光譜，m和n為強度比。

　　需要注意的是，基礎數據集是基于實際采集的數據，包含了與儀器和樣品條件相關的各種因素影響如噪聲和偏差，如激光均方根、模擬/數字轉換噪聲、數字濾波器、PMT電壓、流速、細胞大小等。

　　我們模擬了四種不同的組合： FITC/PE、APC/APC-Cy7、PerCP/PerCP-Cy5.5和AcGFP/FITC。利用兩種不同的算法（LSM和WLSM）對這些數據進行分析，并分析各細胞亞群的區分。相對染色指數是一個標準化的功能性指標，用于量化群體分辨率，定義如下（36,37）。相對染色指數越高，分辨率越高。

　　D:陰陽性群體之間的信號強度差

　　W:陰性峰MFI的2 SD值