以含中間載體質粒的大腸桿菌材料為例進行介紹。
(一)中間載體質粒 DNA 提取(略)
(二)質粒 DNA 限制酶切及探針片段回收
1、操作
(1)限制性內切酶消化
在0.5mL Eppendorf 管中,按如下順序及用量加入試劑,建立 20μL 酶切體系:無菌蒸餾水6μL,10倍緩沖液2μL,質粒 DNA10μL,限制性內切酶I 1μL,限制性內切酶Ⅱ 1μL,用手指輕彈管壁混勻,輕微離心,置37℃水浴中酶解過夜。
(2)瓊脂糖凝膠電泳分離
①配制濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠。
②向酶切反應的離心管內加入 5μL 溴酚藍溶液,混勻,點樣。
③取 2μL 分子量標準 DNA 及 10μL 未經酶切的質粒 DNA,分別與 5μL 溴酚藍混合上樣。
④50V 電壓,電泳1.5h,取出凝膠置紫外燈下,根據相對分子質量標準 DNA 的大小及泳動距離找出探針片段。
(3)探針片段回收
①在紫外燈下,用小刀片將含探針片段的條帶切下,置 1.5mL 的 Eppendorf 管中。
②加入 0.1mL 無菌蒸餾水,用玻棒搗碎凝膠,加蒸餾水至體積為 0.5mL 左右,加入等體積的酚,渦旋振蕩至無明顯的塊狀物。
③將離心管置液氮中冷凍 5min,取出,室溫放置片刻后置37℃水浴中融解。反復操作3次。
④渦旋振蕩均勻,12000r/min 離心10min。
⑤取上清液,加入等體積酚抽提。
⑥取上相,加入等體積氯仿抽提。
取上相,加入2倍體積的無水乙醇,混勻,-20℃放置30min。
⑧13000r/min 離心20min,去上清液,沉淀吹干。
⑨加入適量(不多于10μL)無菌蒸餾水溶解 DNA,測定純度及濃度,備用。
2、說明
回收方法有多種,可查分子生物學實驗手冊。下面為探針標記:
1)隨機引物合成法制備32P 標記 DNA 探針
(1)試材:回收的探針 DNA 溶液(25ng/μL)。
(2)試劑
①DNA 聚合酶I Klenow 片段。
②500mol/L dNTPs 溶液。
③5倍緩沖液:250mmol/L Tris·Cl(pH8.0),25mmol/L MgCl2,10mmol/L DDT(二硫蘇糖醇),1mol/L HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)(pH6.6),隨機六核苷酸引物。
④BSA(不含核酸酶)。
⑤TE 緩沖液。
⑥0.2mol/L EDTA (pH8.0)。
⑦3000 Ci/mmol[a-32P]dCTP。
(3)操作
①取適量待標記的 DNA 溶液,置 0.5mL Eppendorf 管中,于溫水浴中加熱 2～5min,迅速轉入冰水浴中,使之變性。
②取一只無菌硅化 Eppendorf 管,依次加入下列試劑:5倍 buffer 10μL,dNTPs 2μL,變性探針 DNA 溶液1μL,BSA2μL,[a-32P]5μL,DNA 聚合酶I Klenow 片段5μL,蒸餾水補充體積至50μL,溫和地混勻,離心機輕輕離心一下,室溫下放置一至數小時,進行標記反應。
③將反應管置沸水浴中煮沸2min,迅速轉入冰浴中,加入 EDTA 至終濃度為20mmol/L,混勻,可不經純化直接加入到雜交袋中,或置鉛盒中于-20℃保存。注意標記物的半衰期。必要時進行純化。
2)切口平移法制備標記 DNA 探針
(1)試材:回收的探針 DNA 溶液(0.02～0.05g/μL)。
(2)試劑
①1μg/μL DNA 聚合酶I。
②0.2ng/nL DNaseI。
③300μmol/L dNTPs 溶液。
④10倍緩沖液:500mmol/L Tris(pH7.2),100mmol/L MgSO4。
⑤0.2mol/L EDTA(pH8.0)。
(3)操作
①取 dATP,dTTP,dGTP 溶液各10μL,混合成 dNTPs 溶液。
②取一只 Eppendorf 管,依次準確加入下列試劑:蒸餾水18μL,dNTPs 混合物10μL;10倍緩沖液5μL,DNA 0.2μL,[a-32P]DCTP 7μL,DNase I 5μL,DNA 聚合酶I 5μL;總體積50μL,將內容物混勻,置15℃恒溫條件下反應60min。
③加入5μL EDTA 溶液,混勻,終止反應。
3)32P標記的 DNA 探針的純化
探針的純化方法有多種,這里僅介紹 Sephadex G-50 柱層析純化法和乙醇沉淀法。
(1)Sephadex G-50柱層析純化
①試材:標記反應混合液。
②設備:液閃儀或蓋革計數器。
③試劑:葡聚糖凝膠G-50。
④操作
a.處理凝膠及制備層析柱。
b.用移液器將標記反應混合液全部加到層析柱凝膠頂部。用0.1mL TE 或 TEN 緩沖液洗管,待樣品液進入凝膠時,立即將洗管液加到凝膠上。
c.待洗管液進入凝膠時,隨即用 TE 或 TEN 緩沖液進行洗脫。
d.洗脫液流出約 2mL 開始用小管收集洗脫液,每管3滴,用閃爍儀或手提式放射性監測儀測定各管的 cpm(測量儀器測量出的每分鐘的β粒子數)值,第一個 cpm 峰即為標記的DNA 探針。
e.將第一峰的液體收集在一起,用于雜交,或置鉛盒中于-20℃保存,備用。
比活性(cpm/μg)為:第一峰總計數(cpm)÷DNA(μg)
例:標記0.5μg DNA,第一峰共收集5管,每管200μL,各取1L計數,計數值分別是0.2×104cpm,1.0×104cpm,2.4×104cpm,1.0×104cpm,0.4×104cpm總計數為5.0×104×200=1×107cpm。
其比活性為:1×107cpm÷0.5μg=2×107cpm/μg
若計數器的計數效率為50%,則每分鐘粒子的衰變數為:4×107cpm/μg
摻入率為:第一峰總計數/(第一峰總計數+第二峰總計數)×100%
(2)乙醇沉淀法純化探針
①試劑
a.4mol/L 乙酸銨(pH4.5)。
b.0.67mol/L 乙酸銨。
c.67%乙醇。
②操作
a.向標記反應混合液中加入等體積的 4mol/L 的乙酸銨,渦旋混勻。
b.加入2倍體積的無水乙醇,混勻,冰浴上放置15min。
c.37℃水浴加熱2min,不時輕輕攪拌,使沉淀下來的游離標記核苷酸重新溶解。
d.1200離心力離心15min,小心地吸出上清液轉入離心管中。
e.加入0.5mL 0.67mol/L 乙酸按,混勻,用67%乙醇沖洗片狀沉淀,12000離心力離心15min,小心吸出上清液。
f.用90%乙醇洗沉淀,離心,棄去上清液,真空干燥沉淀。
g.用 TE 緩沖液溶解標記 DNA 探針,備用。