《韓非子·外儲說左上》有云 ：“夫良藥苦于口，而智者勸而飲之，知其入而已己疾也”，良藥苦口由此而來。最近，國內研究團隊揭開了這類“苦口良藥”的神秘面紗，成果相繼發表在Nature Genetics（2013）、Science（2014）和Nature Plants（2016）等國際知名學術期刊上。研究者通過研究黃瓜發現：黃瓜苦味正是由三萜化合物葫蘆素C導致的，葫蘆素是一類高度氧化的四環三萜化合物，僅在葫蘆科植物中（黃瓜、西瓜和甜瓜等）發現，苦是這類化合物最顯著的特點，因此，葫蘆素也叫苦味素。極低量的葫蘆素（0.1 mg/L）就能引起明顯的苦味，比典型的苦味劑咖啡因還要苦100倍左右。
圖1.苦味素的來源-黃瓜
苦味素的發現對黃瓜育種和抗腫瘤藥物開發具有重大的意義。植物的生長面對各種外界生物脅迫和非生物脅迫，極苦的苦味素是最佳的防御武器，可用來抵御病蟲害的侵入。因此，苦味素是保護植物的 “綠色農藥”。科學家通過黃瓜功能基因組研究和代謝組學研究發現，可以通過控制黃瓜葉片和果實中苦味素差異積累，培育出葉苦果實不苦的超級優良黃瓜品種。
在印度，極苦的野生黃瓜果實和葉片除了被用作瀉藥，還被用于治療各種炎癥。現代醫學研究發現，甜瓜瓜蒂中的苦味素被提取出來并開發成治療肝病的有效藥物。近年來新發現的苦味素藥用價值引起了人們的關注，苦味素對于腫瘤的治療具有非常好效果。由于黃瓜中苦味素含量極低，因此通過解析苦味素代謝通路和合成生物學技術，提高苦味素的含量對于產業化苦味素應用于臨床腫瘤治療具有非常重大的醫學意義。
苦味素是一種次生代謝物，屬于是代謝組學的研究范疇。什么是代謝組？ “基因組反應了可能將要發生的事情，轉錄組反應了將要發生的事情，而代謝組反應了正在或者已經發生的事情”。生物體的表型性狀是由代謝物的積累直接體現的，如水稻在旱脅迫過程中，水稻葉片ABA的含量會明顯提高；當花青素的含量在西紅柿果實中過量積累時，西紅柿的果實顏色將由紅色變成紫色；長春花長期以來被視為最有效的抗癌植物材料之一，而其中有效的抗癌活性物質是長春花堿（一種生物堿）。因此，植物功能基因組的研究最終都會落實到代謝組與表型組研究中來。
圖2.代謝組是植物性狀的最終體現
苦味素的發現，是我國科學家由基礎科學研究到產業化應用的成功典范，也是基因組與代謝組多組學、多學科整合的成功案例。怎樣才能將“基因組-轉錄組-代謝組”系統的結合起來，開展基礎科學研究、技術轉化及育種呢？今天小編將系統性的介紹黃瓜功能基因組研究如何從最初的基礎科學研究到新品種選育以及抗癌藥物研發的科學故事。
圖3.系統生物學研究內容
1.黃瓜核心種質資源庫的構建
研究團隊通過搜集世界各地的黃瓜種質資源共3300多份材料進行了播種和性狀調查。經過前期設計的23對SSR引物，對3300多份材料進行了指紋圖譜分析（如圖4），根據指紋圖譜，分析了世界黃瓜系譜的演化歷史，挑選了有代表性的黃瓜材料115份，作為黃瓜的核心種質資源庫，可代表所有黃瓜資源 77.2%以上的遺傳多樣性，核心種質資源庫將為黃瓜育種提供新的材料平臺。
圖4.黃瓜核心種質資源的構建和評估（2012，Plos One）
2.構建黃瓜基因組的HapMap圖譜
通過第二代高通量測序技術完成上述挑選的115個黃瓜品系重測序，并對一個野生黃瓜進行了從頭測序。基于這些重測序數據，構建起一個單核苷酸分辨率的黃瓜遺傳變異圖譜。將黃瓜群體分為了4個分化明顯的群體，包括黃瓜的野生祖先印度群體，及其衍生亞群：西雙版納半野生群體、東亞栽培群體和歐洲栽培群體（如圖5）。同時，該研究還發現了一個西雙版納黃瓜特有的突變，該突變導致了編碼β-胡蘿卜素羥化酶的基因是去功能，從而使得西雙版納黃瓜在果實成熟期因不能降解β-胡蘿卜素而呈橙色。這一發現為培育營養價值更高的黃瓜新品種提供了分子育種思路。
圖5.115份黃瓜核心種質重測序材料的群體結構分析（2013，Nature Genetics）
3.黃瓜基因表達譜研究
完成基因組測序后，為了進一步研究黃瓜基因表達水平的差異，該團隊提取了10個黃瓜組織的RNA進行轉錄組研究（如圖6），這些數據一方面提高了黃瓜基因組基因注釋的可靠性和完整性，另一方面也發現了與黃瓜的性別分化、卷須發育和單性結實等相關的重要基因 300多個，進一步豐富了黃瓜功能基因研究。
圖6.黃瓜unigenes GO富集分析（2010，BMC Genomics）
4.黃瓜果實品質等重要農藝性狀相關基因的挖掘
利用重測序結果挖掘了約 1500 個馴化相關基因，闡明了人工馴化和遷移對黃瓜基因組的影響。通過全基因組關聯分析，發現了決定黃瓜性別重要性狀的關鍵基因（如圖7），為進一步研究基因功能提供了重要信息。黃瓜這種不尋常特性是由一個30kb大小DNA片段的拷貝數增加引起，這段重復序列與全雌性高度相關。對全雌花植物來說，有很大的農業生產潛力。這些基因組結構的變異成為將來研究黃瓜基因功能的重要資源，并為充分利用結構變異改良作物，提供了理論基礎。
圖7.一段30.2Kb重復序列決定黃瓜全雌性表型（2015，Plant Cell）
5.黃瓜苦味素合成和β-胡蘿卜素合成的分子機制
完成基因組和轉錄組等研究后，黃瓜的品質性狀研究（代謝組）成為下一個需要突破的研究方向，代謝組是植物農藝性狀和蔬菜營養功能的直接體現。基于前期功能的研究和后續代謝組技術的應用，科學家發現并證明了控制黃瓜苦味素合成的基因信息：控制黃瓜苦味素合成的關鍵基因簇，是由5個串聯基因組成，其中三萜合成酶基因的關鍵突變導致了黃瓜苦味素的合成與否，進一步通過生物化學實驗，證實了該基因簇具有合成苦味素的功能。同時，利用生物信息學篩選、及高效液相色譜檢測（代謝組檢測）等生化分析發現了β-胡蘿卜素水解酶基因的關鍵突變位點（如圖 8），闡明了β-胡蘿卜素在西雙版納黃瓜中大量積累導致果實顏色呈現橙紅色的分子機制，可用于后期“金色黃瓜”的育種。
圖8.全基因組關聯分析發現β胡蘿卜素水解酶基因（2013，Nature Genetics）
短短幾年時間，我國黃瓜基因組研究團隊系統性的結合“基因組-轉錄組-代謝組”，在科學基礎研究領域產出了一系列重大學術成果：Nature Genetics（2009，黃瓜基因組研究），Nature（2011，馬鈴薯基因組研究），Nature Genetics（2013，黃瓜重測序研究），Science（2014，黃瓜苦味合成調控機制），Plant Cell（2015，拷貝數變異決定黃瓜生殖性別），Nature Plants（2016，葫蘆科作物苦味性狀的趨同馴化與差異進化），這些基礎科學研究成果奠基了我國在黃瓜等蔬菜領域基礎研究的國際領先水平。
2014年11月28日出版的國際頂級學術期刊《Science》以長篇幅論文（Research Article）的形式發表了我國科學家完成的黃瓜苦味合成、調控及馴化分子機制研究。這項研究綜合采用了基因組、轉錄組、分子生物學和代謝組學等多種技術手段，解決了長期影響黃瓜生產的一個重大應用問題。該科研團隊，先后開展了黃瓜基因重測序，從1000kg瓜葉中提煉出數毫克的苦味元素（因為普通代謝組檢測技術靈敏度低，難以檢測到低豐度的次生代謝產物）。通過深入挖掘基因組學數據并結合代謝組學、遺傳學、分子生物學等多種研究手段，揭示了9個基因負責苦味物質生物合成的代謝路徑，同時發現這9個基因由兩個“主開關”基因（Bi和Bt）直接控制，Bi控制葉片苦味，Bt控制果實苦味。在野生黃瓜向栽培黃瓜馴化過程中，Bt基因受到選擇，導致無苦味黃瓜的出現。但這個馴化過程并不完全，黃瓜在逆境條件下生長仍然會變苦。
進一步研究發現，Bt啟動子區域有一個新的突變體--SNP1601，能夠使Bt基因在逆境中不表達，可控制黃瓜不會變苦，從而徹底避免苦味對黃瓜品質的影響。黃瓜苦味合成、調控及馴化分子機制的解析，為綜合利用苦味物質葫蘆素創造了契機。通過控制葉片和果實中的“開關”基因 Bi和 Bt，可培育一個新的“超級黃瓜”品種： 既能利用自身合成的苦味物質進行蟲害防御，減少農藥使用；又可確保果實中無苦味合成，保障蔬菜商品品質。育種專家們正在利用這個分子育種方案培育新型黃瓜品種。這是蔬菜基因組研究直接用于品種改良的優秀范例（圖9）。
圖9.培育黃瓜新品種示意圖（2014，Science）
植物中有數以萬計的大相對分子質量次生代謝化合物，它們在植物與外界環境相互作用過程中發揮非常重要的作用。其中萜類化合物是中草藥中的一類比較重要的化合物，主要包含單萜、倍半萜、二萜和三萜等。黃瓜苦味正是由三萜化合物葫蘆素C導致的一類高度氧化的四環三萜化合物，僅在葫蘆科植物中（黃瓜、西瓜和甜瓜等 ）被發現（如圖10），如西瓜和甜瓜中分別富含葫蘆素E和B。
圖10. 葫蘆科作物苦味性狀的趨同馴化與差異進化（2016，Nature Plants）
黃瓜苦味物質葫蘆素具有很好的藥用價值。最早在《本草綱目》中就記載富含葫蘆素的甜瓜瓜蒂具有催吐及消炎的功效。現代醫學研究發現，甜瓜瓜蒂中含有大量的葫蘆素，正是它們發揮了消炎和保肝功效。因此，大量的葫蘆素被提取出來并開發成治療肝病的有效藥物。近年來新發現的葫蘆素藥用價值引起了人們的關注：治療癌癥。葫蘆素可通過特異阻斷腫瘤細胞生長所需的JAK-STAT信號通路來抑制肝癌、膀胱癌、胰腺癌等癌細胞的擴散，可與其他抗癌藥物一塊使用，提高癌癥治療的效果。從這個角度來說， “良藥苦口”是非常有道理的。
雖然野生的葫蘆科植物非常苦，但是，苦味素在植物中的含量并不高，要獲得足量多的葫蘆素進行藥物開發和治療，就必須從植物材料中進行分離和純化。不論是前期大面積的植物種植，還是后期復雜繁瑣的純化過程，都需要大量的時間和很高的成本。葫蘆素屬于結構復雜的大分子，利用化學方法進行合成的難度非常大，且面臨環境污染的風險。因此，要進一步挖掘葫蘆素的藥物潛力，必須借助生物合成的方法進行生產，而生物合成的前提是植物中苦味物質合成代謝通路必須清楚。一旦苦味素代謝合成通路構建完成，可以采用類似體外合成青蒿素的技術，將整個葫蘆素合成代謝通路導入酵母基因組，通過發酵的方式快速、高效合成和改良葫蘆素，為未來開發新的抗癌藥物提供了新的思路和借鑒。
圖11.黃瓜苦味素合成代謝通路模型（2014，Science）
目前，由于現有的非靶向代謝組技術的一些局限性，還無法快速解析不同葫蘆科不同物種的苦味素精細合成通路，延緩了后續開展苦味素藥物開發的應用。隨著廣泛靶向代謝組技術的建立，高通量的精確檢測代謝物成為了可能，為苦味素的產業化應用提供了新的技術平臺。
廣泛靶向代謝組（Widely Targeted Metabolome）：一種整合了非靶向和靶向代謝物檢測技術優點的新型代謝組檢測技術，實現了高通量、高靈敏、廣覆蓋的靶向代謝物檢測，為高效批量定性、定量檢測低豐度代謝物提供了理想的手段（表1）。
表1.廣泛靶向代謝組技術比較
隨著廣靶靶向代謝組技術（廣靶，Widely Targeted Metabolome）的建立，高通量的檢測鑒定黃瓜重要代謝通路的物質成為可能，從而避免文中報道的需要從1噸黃瓜中提取微量苦味素，再通過NMR（核磁共振）技術鑒定物質，一方面研究成本較高，周期較長，同時鑒定到的物質種類非常少，屬于靶向代謝組檢測。目前，邁維代謝提供的廣泛靶向代謝組檢測技術（廣靶）服務，需要提供3-5g鮮樣，批量鑒定1000種代謝物以上，使得代謝組檢測鑒定物質水平大大提高，成功應用在水稻、玉米、油菜、草莓、甜橙等材料中。
在功能基因定位和挖掘研究上，基于廣泛靶向代謝組的代謝組全基因組關聯分析（Metabolic Genome Wide Association Study，mGWAS），在群體材料中可以批量定位近百個基因，優勢遠遠高于傳統GWAS分析（如圖12）。形成了基因組研究與表型組研究（生物學功能研究）的有效紐帶，相關成果發表在Nature Genetics、Nature Communications、PNAS和Plant Cell等期刊。因此，基于廣泛靶向代謝組檢測技術，可以有效鑒定和定位葫蘆素完整合成代謝通路物質和基因，最終通過發酵的方式快速、高效合成和改良苦味素，為未來開發新的抗癌藥物提供了新的方向。
圖12.邁維代謝水稻mGWAS（代謝物全基因組關聯分析）曼哈頓圖（2014，Nature Genetics）
黃瓜功能基因組學的發展，較為系統的完成了系統生物學的研究范疇，通過基因組、轉錄組和代謝組的多組學分析，獲得了黃瓜龐大的基因組信息資源，解析了黃瓜苦味素物質，為后續應用提供了理論基礎。
代謝組是基因組的最終產物，是植物體表型性狀的直接體現。2015年《Science》雜志提到，What’s Next in'Omics: The Metabolome，代謝組將是下一個關注和快速發展的組學。小編相信，不久將來，廣泛靶向代謝組技術將更多的與其他組學結合，解析基因功能和表型性狀，包括苦味素合成通路的其他中間代謝物。最終希望通過廣泛靶向代謝組技術解析整個苦味素合成代謝通路物質，通過發酵的方式快速、高效合成和改良葫蘆素，為未來開發新的抗癌藥物提供了新的思路和借鑒，成為我國下一個“青蒿素”。
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參考文獻：
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