二苯胺法測定DNA含量
【實驗目的】
掌握二苯胺法測定DNA含量的原理和方法
【實驗原理】
DNA分子中2-脫氧核糖殘基在酸性溶液中加熱降解，產生2-脫氧核糖并形成ω-羥基-γ-酮基戊酸，后者與二苯胺試劑反應產生藍色化合物，其反應如下圖。
藍色化合物在595nm處有最大吸收，且DNA在40µg ~400µg范圍內時，吸光度與DNA濃度成正比。在反應液中加入少量乙醛，可以提高反應靈敏度。
【實驗材料】
1.實驗器材
恒溫水浴,721分光光度計。
2.實驗試劑
（1）DNA標準溶液：準確稱取小牛胸腺DNA10mg，以0.1mol/L NaOH溶液溶解，轉移至50ml容量瓶中，用0.1mol／L NaOH溶液稀釋至刻度。濃度為200µg/m1；
（2） DNA樣品液：用上述實驗方法提取的DNA樣品
（3）二苯胺試劑：使用前稱取1g結晶二苯胺，溶于100m1分析純冰醋酸中，加60%過氯酸10m1混勻。臨用前加入1m1 1.6%乙醛溶液。此溶劑應為無色。
【實驗操作】
1．標準曲線的繪制
取干燥試管6支，編號，按表所示加入試劑。
試劑
管號
0
1
2
3
4
5
DNA標準溶液，ml
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸餾水，ml
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
二苯胺試劑，ml
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
A595
加完畢，混勻，于60℃恒溫水浴中保溫1h，冷卻后于595nm處測定吸光度，以零號管作對照，繪制標準曲線。
2．樣品測定
取試管3支，兩支為樣品管，—支為對照管。對照管操作與標準曲線零號管相同。向每支樣品管中加入2m1樣品液及4ml二苯胺試劑，60℃保溫1h，冷卻后于595nm測定吸光度，以對照管調零點。根據測得的吸光度，從標準曲線上查出相應吸光度的DNA含量。
【實驗結果討論】
1．該反應靈敏度較低，但方法簡便，目前仍廣泛使用。
2．其他糖及糖的衍生物、芳香醛、羥基醛和蛋白質等，對此反應由干擾，測定前應盡量除去。