三光子顯微鏡揭示清醒小鼠腦中全部皮質層

　　美國麻省理工學院（MIT）的Picower研究所開發的新型三光子顯微鏡能夠提供高速、低功率的超短光脈沖，能夠到達大腦內的深層目標，而不會造成功能性干擾或物理損傷。它能夠高效地檢測由細胞發出的熒光，并產生具有清晰分辨率和快速幀速率的圖像。三光子顯微鏡使科學家們能夠更深入地觀察大腦，因為較低能量、較高波長的光子比較高能量、較短波長的光子更不容易被細胞分子（如脂質）散射。

從視覺皮層（左側的層1到右側的底板）以2μm的增量采集的450個橫向三光子圖像序列的三維渲染。綠色代表GCaMP6s信號，品紅色代表血管中產生的無標記THG信號和白質中的髓鞘纖維。圖片來源：Murat Yildirim等。

　　研究人員對一臺定制的三光子顯微鏡進行了優化，使用小于20毫瓦的平均激光功率對對清醒的小鼠大于1毫米深的大腦皮層的垂直柱進行成像。他們測量了生理反應和組織損傷閾值，以定義無損傷三光子成像的脈沖參數和安全限值。隨著低能量水平的實現，科學家們開發了一種預啁啾系統來補償顯微鏡中的脈沖展寬，并能夠將樣品上的脈沖寬度減小到40 fs。他們實施了一條延遲線，以提高脈沖重復率并提高幀速率，并在激發和發射路徑中設計光學元件，以最大限度地提高顯微鏡的效率。

　　該研究團隊開發了兩種無標記方法來表征活體小鼠大腦的光學特性，并使用這些特性設計了一種獨特的光學系統。在驗證優化的三光子示波器的測量與雙光子顯微鏡和電生理學的測量結果一致后，研究人員使用他們的顯微鏡觀察清醒老鼠的所有深度超過1毫米的皮層中的神經活動，以觀察細胞對標準視覺輸入的反應。研究人員具有波前成形的雙光子顯微鏡能夠對平均激光功率小于10mW的標記皮質層神經元進行成像，平均激光功率小于20mW的亞平板神經元，平均功率比通過圖像層5神經元所需的平均功率低近一個數量級。

　　研究人員觀察到第5層神經元對多種方向的反應，比其他層中的細胞具有更多的自發活動，并且與更深部的大腦部分有更多的連接。第6層神經元的定向調整比其他層中的神經元稍微更清晰，這意味著它們對不同方向的響應更具特異性。亞板神經元位于皮質層6下方的白質中，并且首次由該團隊表征，顯示出低視覺響應性和寬的方向選擇性。研究人員認為這一發現很有意義，因為許多科學家認為亞板神經元在發育過程中最活躍。

　　研究員Murat Yildirim表示：“我們想要展示我們能夠用三光子顯微鏡技術對清醒狀態下的動物做些什么，這樣我們就可以提出神經科學中的重要問題，你可能認為你擁有世界上最好的顯微鏡，但在你問這些問題之前，你不知道你會得到什么結果。”Mriganka Sur教授表示：“通過優化光學設計和其他參數特征，使得我們能夠在大腦中進行測量，實際上我們能夠創造出以前無法實現的新發現。”